胃癌相关基因启动子甲基化的研究进展

胃癌相关基因启动子甲基化的研究进展
基因启动子甲基化是最早发现的基因表观遗传学修饰 方式之一，ＤＮＡ甲基化的生物学意义在于，胚胎发育中的Ｘ 染色体失活、基因印迹（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）及基因组的结构稳定性等 均与甲基化相关旧。而抑癌基因的启动子甲基化则导致该基
Ｊ Ｄｉａｇｍ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｐ阳ｃｔ ２００９，Ｖ０１．８，Ｎｏ，．１
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诊断学理论与实践２００９年第８卷第１期
三、同源盒基因 同源盒基因（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ）最初是在果蝇的发育调 控研究中发现的一类基因。该类基因无论片段大小．其序列 中均含有一段由１８０～１８３个碱基组成的保守序列．编码的 ６０—６１个氨基酸所构成的多肽区域被称为同源结构域 （ｈｏｍｅｅｄｏｍａｉｎ）或同源盒（ｈｏｍｅｏｂｏｘ）。／ＲＸ（ｉｒｏｑｕｏｉｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ）基因属于易洛魁族同源盒基因。该基因家族有６个成 员，分别为脶ＸＪ。６．其又分成２簇。其中ＩＲＸｌ、ＩＲＸ２与
增强子 沉默子绝绦子基因座控制区近端启动子元件核心启动子 图１ 真核基因袭达的主要调控元件示意图
启动子与基因的转录调控
分子生物学、分子遗传学及其生物医药技术的迅速发 展揭示．真核细胞基因的表达受多层次调控，包括转录调 控、转录后调控、翻译或翻译后调控等。其中在基因转录水 平调控中．启动子发挥着重要作用。
因转录失活．故在肿瘤研究中检测基因启动子区ＣｐＧ岛甲 基化状态．对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断 方法均具重要意义。ＤＮＡ甲基化的检测方法有多种，一种是 利用对甲基化敏感的限制性内切酶酶切ＤＮＡ，然后进行凝 胶电泳分析，其缺点是仅能分析酶切位点处的ＣｐＧ序列甲 基化状态；另一方法是甲基化特异性ＰＣＲ方法ＣＭＳＰ）．其原 理是首先用亚硫酸氢钠修饰基因组ＤＮＡ，所有未发生甲基 化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶．而甲基化的胞嘧啶不变，针 对甲基化和非甲基化的ＤＮＡ序列设计２对引物并进行ＰＣＲ 扩增，将ＰＣＲ扩增产物进行凝胶电泳分析，观察目的基因的 甲基化与否。ＭＳＰ法灵敏度较高．应用范围广。近年来，还发 展了甲基化研究的一些新方法，如高效液相色谱法（ＨＰＬＣ） 和ＰＣＲ产物直接测序法等。
Ｓ密ＮＰ切位相点一关１。５６近２（Ｃ来ＺＩ有＇）报表型道与显浸示润，深
动子区５７９（Ｇ／ｒ）位点与结肠直肠癌发生易感性有关【ｌｑ。随 着人们对基因启动子区ＳＮＰ研究的深入．将有更多的启动 子区ＳＮＰ被识别与鉴定．其在基因转录调控中的作用将成 为基因功能研究的靶点。
ｈＰＭＳ２等，其中起主要作用的是基因ｈＭＬＨ，和＾肘册２。
ＭＭＲ通过修复ＤＮＡ碱基错配、降低自发性突变，从而增强 ＤＮＡ的保真性和维持基因组的稳定性。自从在结肠直肠癌 中第一次报告ＭＭＲ ｈＭＬＨＪ失活与ＤＮＡ甲基化有关以来口Ｉｊ． 相似的表观遗传学改变在胃癌中也被发现。胃癌中同样存 在微卫星不稳定性（ｍｉｃｍｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）亚型．但并 无ＤＮＡ ＭＭＲ发生突变的报道。Ｆｌｅｉｓｈｅｒ等阎检测了６５例胃 癌组织的ｈＭＬＨｌ甲基化情况发现，７７．８％的高频率ＭＳＩ （ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ＭＳＩ，ＭＳＩ，－Ｈ，即多个微卫星位点出现不稳定 性）胃癌存在ｈＭＬＨｌ基因的甲基化，７５％的低频率ＭＳＩ（１０ｗ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ—Ｌ，仅有～个微卫星点不稳定 性）胃癌发生＾舰Ｌ日Ｊ甲基化，仅２３％的无ＭＳＩ胃癌出 现ｈＭＬＨｌ基因甲基化。Ｐｏｐｌａｗｓｋｉ等【２３】通过甲基化敏感限 制性内切酶ＰＣＲ（ＭＳＲＥ．ＰＣＲ）对比分析２７例胃癌患者与 ２５名健康正常人后认为，ｈＭＬＨｌ甲基化对胃癌形成有促 进作用。
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胃癌相关基因启动子甲基化的研究进展
郭晓波。 于颖彦
ｆ上海交通大学医学院附属瑞金医院外科上海消化外科研究所，上海２０００２５）
关键词：肿瘤相关基因；启动子；转录调控
中图分类号：Ｒ７３０．２３１
文献标识码：Ｃ
文章编号：１６７１－２８７０（２００９）０１－００９３－０４
真核生物的启动子结构
人体内能编码蛋白质的基因称为结构基因，结构基因 属断裂基因，即在基因的第一个和最后一个外显子的外侧 各有一段非编码区。又称侧翼序列；在侧翼序列上有一系列 调控序列。包括启动子、增强子、终止子等（见图１）１４】。启动子 是ＲＮＡ聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的ＤＮＡ 序列．是重要的顺式作用元件，其一般位于结构基因５’端上 游区的ＤＮＡ序列。核心启动子（ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）是指在启动子 序列内使ＲＮＡ聚合酶Ⅱ转录起始所必需的最少序列，包括 转录起始位点ｆ相当于ｍＲＮＡ的ＣＡＰ位点，多以腺嘌呤或鸟 嘌呤起始１或起始子及转录起始位点上游一２５／－３０核苷酸处 的富含ＴＡ的典型元件ＴＡＴＡ框。核心启动子单独起作用 时，只能确定转录起始位点。并产生基础水平的转录。上游 启动子元件（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＵＰＥ），包括通常位 于一７０ ｂｐ附近的ＣＡＡＴ框和Ｇｃ框（ＧＧＧＣＧＧ）等。能通过ＴＦ Ⅱ．Ｄ复合物调节转录起始的频率．提高转录效率。组织和发 育特异性基因的表达调控中，除启动子、ＵＰＥ和终止子等基 本调控元件外，通常还有其他类型的顺式作用元件参与，包 括：①加强基因转录的增强子；②抑制转录的沉默子；③能
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嘧啶中５位碳原子上，并与其３’端的鸟嘌呤形成ｍＣｐＧ．在 ＤＮＡ双链中对称出现。细胞分裂中．甲基化特征的传递主要 通过维持性甲基转移酶（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）来实 现。ＤＮＡ甲基化异常可分为甲基化增强、甲基化减弱和甲基 转移酶水平增高３种情况，其中甲基化增强在肿瘤中最常 见，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径。致癌基因多发 生低甲基化。导致其表达开放或表达升高，而抑癌基因的 ＣｐＧ岛高甲基化可导致其表达沉默，使肿瘤抑制活性丧失。 另外．ＤＮＡ的甲基化还可促进肿瘤相关基因突变，因５．甲基 胞嘧啶可自发性或在ＳＡＭ作用下引起邻位脱氨转变为胸腺 嘧啶，使甲基化的ＣｐＧ突变为ＴｐＧ。如抑癌基因ｐ５３中可 见该突变形式，也是甲基化促进恶变的机制之一嘲。ＣｐＧ岛 （ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ）是ＣｐＧ的二核苷酸聚集区域。在基因组内呈不 连续分布。一般长度＞２００ ｂｐ。ＣｐＧ岛通常位于基因的启动子 区域（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ），也可位于第一外显子区域，故又称 ５ ７．ＣｐＧ岛嘲。目前认为，基因的表达与其序列中ＣｐＧ岛甲基 化程度呈负相关。抑癌基因启动子的高甲基化是除基因突 变和基因缺失之外导致基凼失活的另一关键分子机制．如 ｐＳ２、ＤＣＣ等基因在胃癌中的表达下降均与其启动子区ＣｐＧ 岛的高甲基化有关［１０．１１Ｉ。５．杂氮．２．脱氧胞苷（５．．Ａｚａ．－ＣｄＲ）是一 种嘧啶类似物，其作用机制是与ＤＮＡ甲基转移Ｉ（Ｄｎｍｔ Ｉ） 相结合．从而起到抑制甲基化作用。目前较多的针对抑癌基 因失活的体外实验均采用５－Ａｚａ－－ＣｄＲ进行处理，可达到逆转 抑癌基因ｍＲＮＡ表达水平的目的【Ｉ习。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５７２１２７， ３０７７０９６１）；上海市浦江人才计划资助项目（ＰＪ２００７００３６７）； 科技都“８６３”重大专项资助项目（２００６ＡＡ０２Ａ４０２） 通讯作者：于颖彦Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｙａｎ３ｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ。ｃｎ
防止邻近调控元件向侧翼扩散的隔离子ｆ绝缘子）嘲；④结构 更复杂且跨度更大、能克服异染色质沉默效应，促进同一位 点内多个基因协调表达的位点控制区（ＬｃＲ）等。上述组织和 发育特异性表达基因特有的转录调控序列通常无距离和方 向限制．可位于转录基因的上、下游，甚至可存在于远离转录 基因的ＤＮＡ序列中［６１．许多如增强子、沉默子和隔离子等还 分布于与转录基因功能上不相干的邻近基因内含子中同，故 也被称为远距离调控元件。
一，ｐ１６基因与胃癌 ｐ１６基因又称多肿瘤抑制基因（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐ－ ｐｒｅｓｓｏｒ，ＭＴＳ），定位于９ｐ２１位点，全长８．５ｘ１０３（８．５ ｋｂ），由 ２个内含子和３个外显子组成。该基因编码的蛋白是一种重 要的细胞周期负调控蛋白，可通过与细胞周期蛋白依赖激 酶ｃｄｋ４和ｃｄｋ６结合而抑制蛋白激酶活性，起到抑制细胞 增殖作用，被公认是最重要的抑癌基因。Ａｂｂａｓｚａｄｅｇａｎ等ｎ司 通过ＭＳＰ和免疫组化等方法对５２例胃癌患者组织中ｐ１６ 基因甲基化及蛋白表达情况分析后得出ｐ１６启动子区高甲 基化在胃癌发生中起重要作用，并且与胃癌恶性程度相关。 血清中ＤＮＡ甲基化水平的检测可能是胃癌早期检查的一个 有用标志物。Ｆｉｃｏｒｅｌｌａ等【１ｑ研究显示．原发性胃癌中ｐ１６基因 启动子区域高甲基化是导致其转录失活的重要原因。在 Ｗｉｓｔａｒ大鼠实验研究显示。在大鼠胃黏膜向胃癌演变过程 中，ｐ１６基因甲基化是在胃癌发生过程中的早期事件．其甲基 化的频率在正常胃上皮中为２．７％，在慢性萎缩性胃炎中为 １６．７％，在肠上皮化生中为３７．５％。在胃腺瘤中为６４．７％．在 胃癌中则高达８２．５％田。 二、ＤＮＡ错配修复基因（ＭＭＲ）与胃癌 人类ＤＮＡ ＭＭＲ包括｝ＬＭＬＨｌ、ｈＭｓＨ２、ｈＭｓＨ３。ｈＰＭｓｔ、
三、启动子与基因多态性 单核苷酸多态性（ＳＮＰ）是人类基因组遗传变异的最常 见类型，尤其是那些启动子区域的ＳＮＰ对疾病的发生、发展 会产生重大影响【：１３ｌ。理论上讲，启动子区的任何多态性都有 可能改变转录因子与基因的结合能力。增强或减弱该基因 的表达调控。一些研究表明，基因启动子区域的ＳＮＰ可影响 基因表达或部分酶的活性，或可增加或降低人们的患病风 险性．如Ｋｕｒａｏｋａ等【１４Ｊ在对胃癌的研究中发现，正常人胃黏 膜的上皮钙黏素基因（Ｅ．－ｃａｄｈｅｒｉｎ）启动子区为Ｃ，ｃ表型者的 胃癌浸润更深、更容易发生淋巴结转移：Ｍａｔｓｕｍｕｒａ等旧对基 质金属蛋白酶．９（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９，ＭＭＰ－９１）启动子 ＳＮＰ位点一１５６２（Ｃ，Ｉ＇）研究发现，胃癌中ＭＭＰ．９基因启动子
在真核生物的基因组中包含两类功能区域，～类是决 定基因产物结构和功能的编码区．另一类是调控基因时空 表达顺序和表达方式的调控区。调控区包含启动子、增强 子、内含子等为数众多的非编码组分１１－３１。因此。寻找非编码 区中调控单元的编码特征、信息调节与表达规律将是未来 的热点课题。启动子作为基因组中最重要的调控元件。决定 着基因转录启动和转录频率。