免疫印迹(Western Blot)操作规程
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免疫印迹（Western Blot）操作规程
实验目的：免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达
15.14g Tris 10 ml 10% SDS 溶解后调节 pH 到6.8 需要注意的是要在低温调节pH
电极缓冲液：
1L 6g Tris 28.8g Gly 溶解后加10ml 10% SDS 定容到1L
样品处理液：须配制20*buffer 200mM Tris 20mM EDTA pH 8.0
5*loading buffer(see Takara)
组分：250mM Tris-HCL(PH6.8) 10%SDS 0.5%BPB 50%甘油 5%β-巯基乙醇
（2-ME）
1M Tris-HCL(PH6.8) 1.25ml
SDS 0.5g
BPB 25mg
甘油 2.5ml
去离子水溶解后定容到5ml小份（500ul/份）分装后，于室温保存。
使用前将25ul的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading buffer可在室温下保存一个月左右。
实验操作程序：
样品处理
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加
按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF
25mM(sigma)）。
注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
蛋白裂解液：PBS+1%Triton+1%SDS+1*Protease inhibitor cockerIII (蛋白酶抑制剂，MEK:59134-1set)+Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF 25mM(sigma)）。
或者Phosphatase Inhibitor Cocktail III (磷酸酶抑制剂，biovision：K276-1EA) 培养的细胞（定性）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 对于6孔板来说每孔加200~300μl细胞裂解液（PBS+1%Triton100+cocktail er）冰上放置或4℃层析柜水平摇床放置30分钟。
3. 吹打下细胞后在EP管中，超声破碎3-4次，高速离心20分钟，分离上清。
4. 上清中加入5×SDS loading buffer, vortex2~3次,煮沸3-5min。
5. 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于4℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
6. 待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3. 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4. 12000g离心，4℃，2min。
5. 取少量上清进行BCA蛋白定量。
6. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于5×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
组织：
1. 匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
2. 12000g离心，4℃，15min。
3. 取少量上清进行定量。
4. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于5×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
电泳
1. 上样前将胶板下的气泡赶走。
2. 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的PBS+5×loading buffer上样，Marker也用PBS+5×loading buffer调整至与样品等体积。
3. 以恒定电压为160V（Amersham:80-6418-77,160V恒压，电流调至最大）时的电流强度进行电泳。
4. 在溴酚蓝指示剂跑到胶下缘1cm左右结束（分离胶的浓度需要根据目的蛋白的分子大小确定，以目的蛋白跑到胶的中部位置为宜）。
转膜
1. 电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml（甲醇在最后加入，以免挥发），加去离子水至1,000ml。
2. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
3.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。
如用PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和15-30sec。
4.装配转移三明治：海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。
切记：胶放于负极面（黑色面）。
5.将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，300V，300mA,1h（Amersham TE22，恒流，也可以用100V,电流调最大恒压转2-3h）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
6.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
white (+)black (-)
封闭及杂交
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TBST，临用时取200ml PBST 或 TBST加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
1. 封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。
必要时可先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST 将丽春红洗脱后封闭，如用预染蛋白marker则可省略此步。
2. 结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃轻摇过夜。
在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3. 洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4. 结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5. 洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
洗涤时间决定于一抗、二抗稀释比例是否适当。
发光鉴定
Western blot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL 或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。
碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原（WB）监测和核酸检测。
但是做AP实验经常会遇到显色背景偏高的问题，所
以就WB本身来说偏爱HRP的要比AP多。
AP显色底物的生成物主要是蓝紫色，成像好，容易拍照。
但是背景也偏高，整个显色过程更有技术性，有许多个人技巧在里面。
如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。
就生色反应来说，AP显色得灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。
1. HRP-ECL发光法：
将A、B发光液(pierce:34080)按比例稀释混合。
膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2. AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。
将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
