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基于18SrRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

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收稿日期:2008205214 基金项目:国家科技基础条件平台资助项目(2005D KA2120523);国家高新技术研究发展计划“863”资助项目(2006AA10A207);甘肃省自然科学基金资助项目(32S0412A252035) 作者简介:刘光远(19632),男,博士。

基于18S r RNA 基因测序基础上的锥虫分子分类学 刘光远,田占成,龚真莉,谢俊仁,李知新　(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,甘肃兰州730046)摘要:利用18S rRNA 基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究。

用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA ,根据G enBank 中已发表的锥虫18S rRNA 序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR 扩增目的基因片段,将扩增产物连接到p GEM 2T 载体中,经酶切、PCR 确定,进行序列测定。

结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA 基因大小为2188bp 。

利用DNAS 2tar 对试验所获得的这7株锥虫和G enBank 中部分锥虫的18S rRNA 基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树。

核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA 核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%。

关键词:锥虫;18S rRNA 基因;分子分类学中图分类号:S852.72 文献标识码:A 文章编号:100524545(2009)0921140204Phylogenetic relation of Tr y pa nosome based on 18S r RNA gene sequencingL IU Guang 2yuan ,TIAN Zhan 2cheng ,GON G Zhen 2li ,XIE J un 2ren ,L I Zhi 2xin (Key L aboratory ofV eteri nary Parasitolog y of Gansu Provi nce ,S t ate Key L aboratory of V eteri nary Etiological B i 2olog y ,L anz hou V eteri nary Research I nstit ute ,CA A S ,L anz hou 730046,Chi na ) Abstract :The phylogenetic relation of T ry panosoma sp in Hubei ,Guangxi ,Xinjiang ,Zhejiang provinces and astrain of T ry panosoma bruce were analyzed by using 18S rRNA sequence.The genome DNA was extracted f rom the red blood cells or blood of the infected mouse which include as isolates of T ry panosoma f rom these different geo 2graphic areas.The gene specific primers were designed according to the pubulished 18S rRNA sequence at GenBank.The target DNA segment was amplified by polymerase chain reaction ,the PCR product was ligated into p GEM 2T easy vector.It was identified by PCR and sequencing.The results suggested that the length of 18S rRNA gene seven T ry panosoma sp involved in this study was around 2188bp.Two phylogenetic trees was inferred based on 18SrRNA sequence of six T ry panosoma evansi strains in Hubei ,Xinjiang ,Zhejiang ,Guangxi provinces ,a T ry panosoma bruce strain and the other species of T ry panosoma available in G enBank.In the first tree ,it was analyzed that the ho 2mologies of seven T ry panosoma strains were 99.8%,100%,respectively.The homology between them and 6of 13foreign T ry panosoma were 99%2100%,62%between them and 7foreign T ry panosome strains. K ey w ords :T ry panosoma ;18S rRNA ;phylogenetic tree 锥虫(T ry p anosom a )是血鞭毛原生动物,隶属原生动物亚界(Subkindom Protozoa )肉鞭门、动鞭毛纲(Toomastigop horea )、动基体目(K inetoplasti 2da )、锥虫亚目(Trypanosomatina )。

锥虫自1841年首次在鳟鱼中被发现以来,至今国内外报道的己有数百种,其中淡水鱼类就有140多种。

由于具有单一的线粒体2动基体(Single mitochondrion kineto 2plast )等一系列超微结构及相似的外部形态,将锥虫亚目(Trypanosomatina )和波豆亚目(Bodonina )归为动基体目。

波豆亚目的系统发育方式是并系发育(parap hyletic ),这已经得到了广大研究者的认可[1],但对锥虫亚目的系统发育方式一直存在较大的争论。

早期,人们认为锥虫亚目的系统发育方式与波豆亚目的系统发育方式一样,都是并系发育。

Maslov 等[2]用18S rRNA 基因分析法对动基体目原生动物寄生虫进行分析,系统发育树中包括了布氏锥虫、枯氏锥虫和一种鱼类锥虫,系统发育树显示锥虫是并系发育的。

这与G omez 等[3]的研究结果一致。

随着更多锥虫种类被发现和报道,锥虫系统发育研究有了新的进展。

Maslov等[4]采用SSU rRNA和L SU rRNA基因分析法构建了系统发育树,其锥虫种类有7种,聚类分析的结果是,布氏锥虫仍在锥虫的主进化支外,新引入的L eishm ani a和Crit hi di a也不在锥虫的进化支里;但从进化树上第一次发现,除布氏锥虫之外,锥虫可能是单系发育的。

随后,L ukes等[5]明确提出锥虫是单系发育的,在构建锥虫系统发育树时,分别引入24种和47种,结果都很明确地支持单系发育的观点。

后来,Hagg 等[6]通过研究发现,在不同的进化支之间有折叠替代率差异,证实了L ukes等[5]的观点。

开展锥虫系统发育研究,SSU rRNA基因方法并不是唯一的,其他rRNA基因序列和蛋白质编码基因也被用到了锥虫系统发育研究中。

同时使用18S rRNA和部分28S rRNA基因序列,得出的结论与上面相同:引入较少种类时显示锥虫是并系发育的,而当引入的种类为11种时,锥虫是单系发育的[728]。

在分子生物学上,对于锥虫的种类可通过锥虫的动基体环DNA序列分析来定性。

伊氏锥虫的动基体小环序列可分为A型和B型,肯尼亚地区伊氏锥虫的动基体小环序列存在A型和B型2种[9]。

Njiru等[10]认为伊氏锥虫骆驼株很有可能具有B型动基体小环,同时亚洲的伊氏锥虫被认为只具有A 型动基体小环序列。

故而可以推断亚洲的伊氏锥虫的发育遗传变化应都是一致的。

为了进一步从18S rRNA序列分析角度进行进一步佐证,本研究利用分子生物学方法,以分离于我国湖北、广西、浙江、新疆等地区的不同动物的伊氏锥虫的6个虫株以及国外引进的布氏锥虫为研究对象,克隆虫体18S rRNA基因序列,并进行序列测定和绘制系统发生树。

旨在为采用分子生物学方法对锥虫不同种株进行分类地位的确定,同时进一步为设计锥虫不同种株的分子生物学鉴别诊断方法奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料　湖北、广西、新疆、浙江4个地区的伊氏锥虫虫种和布氏锥虫活虫种,共7个虫株,均由本实验室收集并于液氮中保藏。

1.2　总D NA的提取、18S r RNA全序列的扩增及序列测定　按基因组DNA纯化试剂盒说明从含虫血中提取基因组DNA。

18S rRNA基因扩增通用引物为:S上:5′2CA TA T GC T T GT T TCAA GGAC23′和S下:5′2GAC T T T T GCT TCCTC TA T T G23′[11]。

PCR反应体系的总体积为50μL,包括10×PCR buffer5μL,2.5mmol/L dN TP Mixt ure4μL,Taq DNA聚合酶0.25μL(Ta KaRa,5U/μL),引物(20μmol/L)各1μL,基因组DNA5～10ng,使用去离子水将反应总体积补充至50μL。

94℃预变性5 min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸7min。

PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用DNA凝胶回收试剂盒纯化。

将纯化产物进一步连接到p GEM2T载体,经酶切、PCR确定,送大连宝生物公司进行序列测定。

1.3　系统发育分析　将我国的伊氏锥虫各地方株及布氏锥虫的18S rRNA序列采用DNAStar软件中Clustal W序列对接方法进行关系分析,确定不同区域锥虫虫株的同源性及差异。

2　结果2.1　基于18S r RNA基因序列整合数据的系统发生分析　利用获得的数据,与GenBank已有的大部分锥虫虫株的18S rRNA序列比较建立了进化树(图1)。

伊氏锥虫、布氏锥虫和马媾疫锥虫与非洲刚果锥虫明显分为2个分支,而国内与国外的伊氏锥虫株、布氏锥虫和马媾疫锥虫株的18S rRNA序列同源性接近100%。

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三种蛾类线粒体基因组及双孔次目(鳞翅目：有喙亚目)相关类群的系统发生分析

三种蛾类线粒体基因组及双孔次目(鳞翅目：有喙亚目)相关类群的系统发生分析

三种蛾类线粒体基因组及双孔次目（鳞翅目：有喙亚目）相关类群的系统发生分析双孔次目是鳞翅目、有喙亚目下的一个全变态昆虫类群,全世界已知种类超过157 000多种,包括全部的蝶类和大多数的蛾类,占全部鳞翅目种类的99%左右。

该类昆虫分布十分广泛,与人类的生产和生活活动密切相关,在自然生态系统中占有极其重要的位置。

另外,其中的一些类群已成为昆虫学和进化生物学相关领域重要的研究对象和模式生物。

然而,迄今为止,有关双孔次目各主要类群间的整体系统发生关系格局尚不明晰,一些类群的系统学地位等问题还存在很多争议,特别是基于形态学和分子生物学的一些研究结果还远未达成共识。

昆虫的线粒体基因组是大小为15<sup>1</sup>9 kb的共价闭环分子,通常包含13个蛋白质编码基因（PCG）、2个rRNA基因,20余个tRNA基因和一个非编码的AT富集区（AT-rich region）。

由于它分子量相对较小,携带较为丰富的遗传信息,母系遗传等特点,现已被广泛运用于昆虫其他动物类群的系统分类学的研究中。

为了进一步解析双孔次目及其内部有关类群的系统发生关系,本研究新测了3种蛾类（玉带斑蛾、铅斑钩蛾和白缘寡夜蛾,分属于斑蛾总科,钩蛾总科和夜蛾总科）的线粒体基因组全序列,结合已知的其他双孔次目昆虫代表种类的线粒体基因组序列数据,对它们的线粒体基因组结构和组成做了详尽的比较分析;另外,根据13个蛋白质编码基因的核苷酸序列数据,运用贝叶斯演绎法（BI）最大似然法（ML）重建了双孔次目共72个代表种类的系统发生树,以此探讨它们主要类群之间的系统发生关系。

与此同时,结合GenBank中已知有关基因序列数据,以贝叶斯演绎法、最大似然法和邻接法（NJ）法的方法重建了3个总科（斑蛾总科,钩蛾总科和夜蛾总科）内部有关类群代表种群间的系统发生关系。

线粒体基因组比较分析的研究结果显示,玉带斑蛾、铅斑钩蛾和白缘寡夜蛾的线粒体基因组长度分别是15 383bp、15 564bp、15 320bp。

研究生入学考试生物化学(核酸)历年真题试卷汇编3

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研究生入学考试生物化学（核酸）历年真题试卷汇编3(总分：70.00，做题时间：90分钟)一、判断题请判断下列各题正误。

(总题数：10，分数：20.00)1.(复旦大学2008年考研试题)核酸与蛋白质一样也有等电点。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：2.(复旦大学2008年考研试题)Cot曲线分析可以用来检测真核生物基因组中是否有重复DNA序列。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：3.(复旦大学2008年考研试题)SDS不能与DNA结合的原因是DNA上带负电荷。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：4.(复旦大学2008年考研试题)Pauling最早提出蛋白质的变性是氢链遭到破坏。

（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：最早提出蛋白质的变性是氢链遭到破坏的是我国化学家吴宪。

而：Pauling是提出了α螺旋和β折叠是蛋白质二级结构的基本构建单元的理论。

5.(中山大学2009年考研试题)RNA干扰技术是一种抑制DNA转录出RNA的技术。

（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：RNA干扰技术是引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。

6.(中山大学2009年考研试题)活细胞中tRNA的空间结构呈“三叶草”型。

（分数：2.00）A.正确B.错误√解析：解析：活细胞中tRNA的空间结构呈倒L型。

7.(中山大学2009年考研试题)RNA病毒的复制通常不需要引物。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：8.(中山大学2009年考研试题)原核生物DNA通常仅有一个复制起点，而真核生物DNA通常有多个复制起点。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：9.(中山大学2007年考研试题)原核生物基因组包括少量的非转录DNA，如复制和转录的调控区域。

（分数：2.00）A.正确√B.错误解析：10.(中山大学2007年考研试题)真核生物基因组中通常有数百个rRNA基因拷贝。

五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编38-遗传的分子基础-人类探索遗传物质的历程

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五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编38-遗传的分子基础-人类探索遗传物质的历程（含解析）一、单选题1．（2022·重庆·统考高考真题）下列发现中，以DNA双螺旋结构模型为理论基础的是（）A．遗传因子控制性状B．基因在染色体上C．DNA是遗传物质D．DNA半保留复制2．（2022·辽宁·统考高考真题）选用合适的实验材料对生物科学研究至关重要。

下表对教材中相关研究的叙述，错误的是（）选项实验材料生物学研究A 小球藻卡尔文循环B 肺炎链球菌DNA半保留复制C 枪乌贼动作电位原理D T2噬菌体DNA是遗传物质A．A B．B C．C D．D 3．（2022·河北·统考高考真题）关于遗传物质DNA的经典实验，叙述错误的是（）A．摩尔根依据果蝇杂交实验结果首次推理出基因位于染色体上B．孟德尔描述的“遗传因子”与格里菲思提出的“转化因子”化学本质相同C．肺炎双球菌体外转化实验和噬菌体浸染细菌实验均采用了能区分DNA和蛋白质的技术D．双螺旋模型的碱基互补配对原则解释了DNA分子具有稳定的直径4．（2022·海南·统考高考真题）某团队从下表①～④实验组中选择两组，模拟T2噬菌体侵染大肠杆菌实验，验证DNA是遗传物质。

结果显示：第一组实验检测到放射性物质主要分布在沉淀物中，第二组实验检测到放射性物质主要分布在上清液中。

该团队选择的第一、二组实验分别是（）T2噬菌体大肠杆菌①未标记15N标记②32P标记35S标记③3H标记未标记④35S标记未标记A．①和④B．②和③C．②和④D．④和③5．（2022·湖南·高考真题）T2噬菌体侵染大肠杆菌的过程中，下列哪一项不会发生（）A．新的噬菌体DNA合成B．新的噬菌体蛋白质外壳合成C．噬菌体在自身RNA聚合酶作用下转录出RNAD．合成的噬菌体RNA与大肠杆菌的核糖体结合6．（2022·广东·高考真题）下列关于遗传学史上重要探究活动的叙述，错误．．的是（）A．孟德尔用统计学方法分析实验结果发现了遗传规律B．摩尔根等基于性状与性别的关联证明基因在染色体上C．赫尔希和蔡斯用对比实验证明DNA是遗传物质D．沃森和克里克用DNA衍射图谱得出碱基配对方式7．（2022·浙江·高考真题）下列关于“噬菌体侵染细菌的实验”的叙述，正确的是（）A．需用同时含有32P和35S的噬菌体侵染大肠杆菌B．搅拌是为了使大肠杆菌内的噬菌体释放出来C．离心是为了沉淀培养液中的大肠杆菌D．该实验证明了大肠杆菌的遗传物质是DNA8．（2022·浙江·统考高考真题）S型肺炎双球菌的某种“转化因子”可使R型菌转化为S 型菌。

分子生物学考试整理笔记

分子生物学考试整理笔记

分⼦⽣物学考试整理笔记第⼀章1.请定义DNA重组技术和基因⼯程技术。

DNA重组技术：是将不同的DNA⽚段按照⼈们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表的，产⽣影响受体细胞的新的遗传性状。

基因⼯程技术：是将不同的DNA⽚段按照⼈们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表的，产⽣影响受体细胞的新的遗传性状。

还包括其他可能使⽣物细胞基因组结构得到改造的体系。

第⼆章2.什么是核⼩体？简述其形成过程。

由DNA和组蛋⽩组成的染⾊质纤维细丝是许多核⼩体连成的念珠状结构。

核⼩体是由H2A,H2B,H3,H4各两个分⼦⽣成的⼋聚体和由⼤约200bp的DNA组成的。

⼋聚体在中间，DNA分⼦盘绕在外，⽽H1则在核⼩体外⾯。

每个核⼩体只有⼀个H1。

所以，核⼩体中组蛋⽩和DNA的⽐例是每200bpDNA有H2A,H2B,H3,H4各两个，H1⼀个。

⽤核酸酶⽔解核⼩体后产⽣只含146bp核⼼颗粒，包括组蛋⽩⼋聚体及与其结合的146bpDNA，该序列绕在核⼼外⾯形成1.75圈，每圈约80bp。

由许多核⼩体构成了连续的染⾊质DNA细丝。

核⼩体的形成是染⾊体中DNA压缩的第⼀阶段。

在核⼩体中DNA盘绕组蛋⽩⼋聚体核⼼，从⽽使分⼦收缩⾄原尺⼨的1/7。

200bpDNA完全舒展时长约68nm,却被压缩在10nm的核⼩体中。

核⼩体只是DNA压缩的第⼀步。

核⼩体长链200bp→核酸酶初步处理→核⼩体单体200bp→核酸酶继续处理→核⼼颗粒146bp3. 简述DNA的⼀,⼆,三级结构的特征DNA⼀级结构：4种核苷酸的的连接及排列顺序，表⽰了该DNA分⼦的化学结构DNA⼆级结构：指两条多核苷酸链反向平⾏盘绕所⽣成的双螺旋结构DNA三级结构：指DNA双螺旋进⼀步扭曲盘绕所形成的特定空间结构4.原核⽣物DNA具有哪些不同于真核⽣物DNA的特征？（1）结构简练：原核DNA分⼦的绝⼤部分是⽤来编码蛋⽩质，只有⾮常⼩的⼀部分不转录，这与真核DNA的冗余现象不同。