H5N1亚型禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的研究

荧光RT-PCR快速检测禽流感病毒H5亚型的研究朱文斯;赖平安;黄茜华;张鹤晓;杨伟【期刊名称】《中国医药导刊》【年(卷),期】2003(005)001【摘要】本研究根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段,设计、合成多对引物、探针,并通过筛选获得灵敏度、特异性好的组合,在此基础上对荧光RT-PCR反应体系中的各组分进行优化,并建立对各种禽类样品中病毒核酸的提取方法.通过对阳性鸡胚尿囊液及人工攻毒的SPF鸡、肉鸡、肉鸭的各脏器进行检测,并与传统鸡胚病毒分离进行对比,显示该方法与传统鸡胚病毒分离灵敏度接近,但检测时间由原来的21天缩短为4小时.【总页数】4页(P27-30)【作者】朱文斯;赖平安;黄茜华;张鹤晓;杨伟【作者单位】深圳市匹基生物工程股份有限公司,深圳,518000;国家质检总局动植物检疫实验所,北京,100029;深圳市匹基生物工程股份有限公司,深圳,518000;国家质检总局动植物检疫实验所,北京,100029;深圳市匹基生物工程股份有限公司,深圳,518000【正文语种】中文【中图分类】R9【相关文献】1.TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒 [J], 卢亦愚;严菊英;冯燕;徐昌平;史雯;茅海燕2.双重RT-PCR同时快速检测H5亚型禽流感病毒和新城疫病毒强毒株 [J], 张斌;汤承;张兆敏;马莉;刘小银;李明义;岳华3.禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法研究 [J], 杨素;廖秀云;廖明;沙才华;徐海聂;曹伟胜;陈伟生4.TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒 [J], 马莉;汤承;岳华;李明义;张彬;张兆敏5.实时荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒 [J], 吕恒;张锦海;王长军;顾海涛;王平;鲁娟东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用蒋文明;李阳;程善菊;刘华雷【摘要】H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大.为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化.以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100％、98％、98％.敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1 fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍.结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2019(036)003【总页数】5页(P87-91)【关键词】H5亚型;禽流感;实时RT-PCR;敏感性;特异性【作者】蒋文明;李阳;程善菊;刘华雷【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,国家禽流感专业实验室,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,国家禽流感专业实验室,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,国家禽流感专业实验室,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,国家禽流感专业实验室,山东青岛266032【正文语种】中文【中图分类】S852.651996年，我国首次从广东省鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[1]。

从2003年末开始，H5N1亚型禽流感疫情在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。

2004—2015年，我国多个省份暴发H5N1亚型高致病性禽流感疫情，导致超过2 000万只禽类被扑杀，给养禽业造成巨大经济损失。

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究摘要：实时的荧光RT—PCR检测技术，是在常规PCR平台上发展出来的量化PCR工艺技术，通过在PCR的反应系统中添加了大量荧光反应基团，之后再经过大量荧光数据的积累，就可以即时的监控了整个PCR流程，之后又利用x射线断层成像数据的标准曲线，对所有未知模型都实现了定性分析。

关键词：RT—PCR；活禽和禽组织；禽流感病毒；研究目前中国国内对禽流感的鉴别与检测，大多采取病原分离方法和血清学检测.虽然病原分离方法是一个比较准确的检测方式，但由于具有费时太远、操作程序复杂等弊端，因此无法广泛应用在对禽流感的快速监测上.而血清学方法大多用于测定抗体水平，而目前正在大量应用疫苗的状况下，也制约着这种方式的广泛应用.所以，寻求一个迅速、灵敏的检测技术用于测定动物及产品中的禽流感病毒，已成为当前中国禽流感检测工作的主要当务之急.荧光RT-PCR技术是指使用由A型流感病毒共有基因组特异序列所制备的一个特异性引物，与一个特殊的荧光双标探测器发生PCR反应，再利用检测器所吸收的荧光值来确定结果.该技术具备迅速、灵敏、特异、精确、安全和使用简便等优势，已成为当前检验禽流感的重要标准，由国家市场监督管理局按照规定在全国所有的大中型家禽产品出口公司所在地的政府直属部门试行.但因为该种技术所用的仪器设备和试剂都比较价格昂贵，所以目前普及使用还有相当难度.为了如何衡量该种技术和常规方法之间的相互关系及其它们技术上的相似性，本试验所分别使用了俩种禽流感的通用RT-PCR方式，对禽流感H9亚型病毒及实际样品开展了检验，以期在快速、敏感度、特殊和实用性等领域开展了对比，为禽流感检验办法的制定提出了理论依据。

1.禽流感病毒分型及病原结构和特点禽流感,是由A型流感病毒所导致的一个禽类病毒性综合征。

因为它从1878年开始在德国蔓延,当时被人们称为“鸡瘟”。

禽流感病毒一般根据其致病性分成高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和不致病性禽流感病毒。

专利名称：H5亚型禽流感病毒变异株的多重PCR检测方法专利类型：发明专利
发明人：彭大新,刘秀梵,吴艳涛,陈素娟,张小荣,徐全刚,刘金彪
申请号：CN201010180500.X
申请日：20100521
公开号：CN101875979A
公开日：
20101103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种多重PCR检测H5亚型禽流感病毒变异株的方法。

该方法是利用3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定：A型流感毒株出现300bp的型特异条带，H5亚型流感病毒出现173bp的亚型特异条带，变异株出现559bp 的特异条带。

为禽流感和变异株的快速诊断提供了新的方法，为疫苗的选择提供指导作用。

申请人：扬州大学
地址：225009 江苏省扬州市大学南路88号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：卢亚丽
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某某公司H亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法(一)某某公司H亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法随着科技的不断发展，越来越多的检测方法被发明，其中包括了患者、食品和环境等多个方面。

其中，针对禽流感病毒的检测方法也是日益完善。

下面，我们介绍某某公司H亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法，希望能在禽流感防控中发挥作用。

1.检测方法原理H亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法属于分子生物学检测方法，主要是利用荧光定量PCR技术检测H亚型禽流感病毒的特异性基因，可以快速、准确地检测出病毒是否存在及其数量。

2.样品的准备首先，将样品收集储存在68℃及以下条件下，以保持样品的活性。

待需要时，将样品从储存温度中取出，经标准方法处理后制成核酸提取物，供实验参考。

3.实验步骤a.检测试剂的配制将检测试剂中的反转录酶、Taq酶及反应缓冲液等标准试剂按照配方比例制成反应体系试剂。

b.核酸反应将样品提取得到的核酸溶液与上述反应体系试剂混合后进行核酸反应，目的是将RNA转化为cDNA，并进行PCR扩增。

c.荧光检测将PCR扩增产物与某某公司特制荧光探针掺入至荧光定量PCR体系中，并进行荧光检测。

病毒的存在可以从荧光检测的数据中快速判断。

4.检测结果的判读样品核酸浓度与检测荧光值成正比，因此，通常用荧光值来判别样品的阳性或阴性，同时可根据不同的荧光值来判断样品中病毒含量的高低。

总之，某某公司H亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是基于分子生物学原理的一种高灵敏、高特异性和高通量的禽流感检测方法。

其具有快速、准确和高通量的特点，是禽流感防控领域中一种重要的检测方法。

一步单管多重RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒刘金华;魏卉玲;周迎春;樊玉磊
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2004(020)0z1
【摘要】@@ 高致病性禽流感通常都是由H5和H7亚型禽流感所引起,可对养殖业造成致命性的打击.2004年初在亚洲广泛暴发的H5N1亚型禽流感,使亚洲十几个国家和地区的养殖业遭受了严重的经济损失,而且在泰国和越南感染人并致多人死亡.控制和扑灭禽流感的重要措施是必须及时能够确诊.传统的鸡胚接种分离病毒方法,虽然灵敏度和准确度很高,但是耗时长,不能满足临床快速诊断的需要.
【总页数】1页(P47)
【作者】刘金华;魏卉玲;周迎春;樊玉磊
【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业大学动物医学院,北京,100094
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.多重RT-PCR快速检测鉴别H7亚型禽流感病毒方法的建立 [J], 庞耀珊;谢芝勋;邓显文;唐小飞;刘加波
2.多重RT-PCR快速检测禽流感病毒的研究 [J], 陈思怀;乔宪凤;华文君;郑新民;魏
庆信;张涌
3.禽流感病毒 H5、H7和 H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立 [J], 屈素洁;莫胜兰;邹联斌;胡杰;张步娴;梁媛;粟艳琼;施开创;李军
4.多重RT-PCR快速检测鉴别H7亚型禽流感病毒方法的建立 [J], 庞耀珊;谢芝勋;邓显文;唐小飞;刘加波;
5.禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立 [J], 耿士忠;曾显营;潘志明;黄金林;焦新安;刘秀梵
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畜牧兽医学报 2010,41(3):305-309Acta Veterinaria et Zootechnica S inica中国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析李雁冰,施建忠,赵海丹,田国彬,王 冬,宋家升,杨德全,邓国华,王秀荣,陈化兰*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点开放实验室/国家禽流感参考实验室/农业部动物流感重点开放实验室,哈尔滨150001)摘 要:对引起中国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株 A/chicken/Shanx i/2/ 2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。

结果表明该病毒具有高致病性禽流感病毒(H P AI V)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与中国传统H5N1亚型禽流感病毒G S/GD/1/96(H5N1)存在较大差异,属于新的基因型 山西鸡型;抗原性分析结果表明其在抗原性方面与GS/GD/1/96同样存在较大变异,将其命名为 山西鸡型 抗原变异株;以106EI D50 0 1mL-1剂量将该病毒经鼻腔接种4周龄SPF鸭以评价其对水禽的感染能力,结果表明其不感染鸭;常规方法接种BAL B/c小鼠以评价其对哺乳动物的感染和致病能力,结果表明其能感染小鼠,但不引起死亡,呈低致病力。

说明该类型高致病性H5N1H PA IV目前仅危害鸡,不具备感染水禽的能力,感染哺乳动物但不致死。

该类型病毒的出现与流行为中国禽流感的免疫与防制提出新的课题。

关键词:H5N1H P AI V;CK/SX/2/06;山西鸡型;抗原变异中图分类号:S852 659 5 文献标识码:A 文章编号:0366-6964(2010)03-0305-05 Identification of an Antigenic-drifted H5N1Highly Pathogenic Virus in ChinaLI Yan-bing,SH I Jian-zhong,ZH AO H a-i dan,T IAN Guo-bin,WANG Dong,SONG Jia-sheng,YANG De-quan,DENG Guo-hua,WANG Xiu-rong,CH EN H ua-lan*(A nimal I nf luenz a L abor atory of the Ministr y of A gr iculture/N ational A v ian I nf luenz a R ef er ence L abor atory/N ational K eyL abor atory of Veterinary Biotechnology,H ar bin Veter inar y Resear ch I nstitute,Chinese A cademy of A gr icultur al S ciences,H ar bin150001,China)Abstract:In order to ev aluate an av ian influenza virus-CK/SX/2/06(H5N1),w hich w as isolated fro m a poultry farm in Shanx i province.H A-H I test,RT-PCR,IVPI,antigenic analysis,se-quencing and phylo genic analysis,aquatic bird and BALB/c mice infectio n test w ere fulfilled in the study.T he virus w ere H5N1subty pe hig hly pathogenic avian influenza virus(H PAIV), w hich show ed big diversity to reference strain GS/GD/1/96(H5N1)in China in phy logenic and antigenic analy sis.So it w as defined as antig enic-drifted str ain,the sam e viruses established a new clade,Shanx i chicken-like strain,compared w ith the same subty pe viruses w hich caused H5N1H PAI o utbreak in China in recent years.T he virus didn t infected SPF duck and show ed收稿日期:2009-08-03基金项目:农业部动物流感监测与防制财政专项项目资助作者简介:李雁冰,博士,副研究员,主要从事禽流感病原学与分子生物学研究,E-mail:lyb@*通讯作者:陈化兰,E-mail:hlchen1@yah 畜 牧 兽 医 学 报41卷low pathog enic to mamm al.These results indicated that new clade and antigenic-drifted v ir uses Shanx-i like strain appeared in China,so w e should adjust the measurement and strategy to pre-v ent and control the disease.Key words:H5N1H PA IV;CK/SX/2/06;Shanxi chicken clade;antigenic-drifted2006年2月3日,山西省阳泉市某种鸡场发生禽流感疫情。