纤维素酶高产菌株的诱变育种

紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。

而我国由于受人口多、耕地少的双重制约，粮食供应形势尤为严峻。

因此，我国畜牧业要稳定持久发展，就必须减少对粮食的依赖[1]。

一、选择题1．以下关于育种的表达中，正确的选项是( )A ．用物理、化学等因素诱变处理可提高突变率B ．诱变育种和杂交育种均可形成新的基因C ．三倍体植物不能由受精卵发育而来D ．诱变获得的突变体多数表现出优良性状解析： 物理、化学等因素是诱发基因突变的因素，可以提高突变率；诱变育种的原理是基因突变，可以产生新的基因，杂交育种的原理是基因重组，不产生新基因，可以产生新的基因型；二倍体经过秋水仙素处理可诱导成四倍体，在开花时授以二倍体的花粉，就可以受精形成受精卵，之后发育成种子，萌发长成三倍体植物；基因突变的特点之一是突变性状对生物体多数是有害的。

答案： A2．用纯种的高秆(D)抗锈病(T)小麦与矮秆(d)易染锈病(t)小麦培育矮秆抗锈病小麦新品种的方法如下：高秆抗锈病小麦×矮秆易染锈病小麦――→①F 1――→②雄配子――→③幼苗――→④选出符合要求的品种。

以下有关此种育种方法的表达中，正确的选项是( )A ．过程①是杂交B ．过程④必须使用生长素处理C ．过程②是自交D ．过程③必须经过受精作用 解析： 在这个培育过程中运用了杂交育种和单倍体育种技术，过程①是杂交过程，A 正确；过程②是减数分裂过程，产生配子，C 错误；过程③是花药的离体培养过程，获得单倍体植株，D 错误；过程④是染色体加倍的过程，通常用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，B 错误。

答案： A3．用纯合的二倍体水稻品种高秆抗锈病(DDTT)和矮秆不抗锈病(ddtt)进行育种时，一种方法是杂交得到F 1，F 1再自交得F 2；另一种方法是用F 1的花药进行离体培养，再用秋水仙素处理幼苗得到相应植株。

以下表达正确的选项是( )A ．前一种方法所得的F 2中重组类型和纯合子各占5/8、1/4B ．后一种方法所得的植株中可用于生产的类型比例为2/3C ．前一种方法的原理是基因重组，原因是非同源染色体自由组合D ．后一种方法的原理是染色体变异，是由于染色体结构发生改变引起的解析： 杂交育种F 2中重组类型有DDtt(1/16)、ddTT(1/16)、Ddtt(2/16)、ddTt(2/16)，占3/8；单倍体育种的原理是染色体数目变异，由于F 1产生的四种配子的比例为1∶1∶1∶1，故用此法所得植株中纯合类型占1/4；杂交育种的原理是基因重组，原因是非同源染色体的自由组合。

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计摘要纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半。

目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还会造成环境污染。

利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。

本设计采用目前认为是最好的产纤维素酶的菌种里氏木霉作为发酵菌种，液体深层发酵过程中采用变温发酵的方法分别控制菌种的生长和产酶，提取过程中采用超滤、层析等，提高产品的收率。

最后采用喷雾干燥做成固态的酶制剂。

本设计的主要内容有：工厂总平面布置、全厂工艺流程设计、工艺计算、设备的计算与选型、成本核算；另外，完成设计图纸8张，有工厂总平面布置图、工艺流程图（3张）、发酵罐设计图、种子罐设计图、发酵车间设备布置图（平面图和立面图）。

根据全厂工艺设计和计算结果可以看出，该设计能够达到工业生产的要求。

关键词：纤维素酶；液体深层发酵；里氏木霉ABSTRACTCellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on.This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring .The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory，the calculation of the craft，the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can come up to the request of industrialization.Keywords: Cellulase; liquid submerged fermentation;; Trichoderma reesei目录1 绪论11.1纤维素酶简介11.2纤维素酶的研究状况 11.2.1国外研究概况 (2)1.2.2国内研究概况 (3)1.3 纤维素酶的应用 41.3.1 纤维素酶在果实和蔬菜加工上的应用 (4)1.3.2 纤维素酶在酱油酿造上的应用 (4)1.3.3 纤维素酶在酒精发酵中的应用 (5)1.3.4纤维素酶在饲料上的应用 (5)1.3.5在麻棉混纺织物后整理中的应用 (6)1.3.6其它 (6)1.4纤维素酶的发展前景 61.5纤维素酶的生产61.5.1固体发酵生产纤维素酶 (6)1.5.2液体深层发酵生产纤维素酶 (7)1.5.3固定化酶和细胞 (9)1.6目前国内的有关情况 91.6.1国内的需求情况 (9)1.6.2主要技术指标 (9)1.6.3国内几大生产厂家 (10)1.7本设计的目的和内容 101.7.1本设计的目的 (10)1.7.2本设计的主要内容 (10)2 全厂工艺流程及论证122.1无菌空气工艺论证122.1.1无菌空气制备系统工段工艺论证 (12)2.2发酵工段工艺论证132.2.1发酵工艺流程 (13)2.2.2菌种选取 (13)2.2.3培养基 (14)2.2.4生产方法 (14)2.2.5发酵过程的控制 (14)2.3后提取工段工艺论证 152.3.1后提取工艺流程 (15)2.3.2提取方法论证 (15)3 纤维素酶的工艺计算183.1物料衡算183.1.1工艺指标 (18)3.1.3提取工段的物料衡算 (19)3.2热量衡算203.2.1蒸气消耗计算 (20)3.3水平衡计算223.3.1种子罐冷却水 (22)3.3.2发酵罐冷却水 (22)3.4无菌空气衡算223.4.1发酵罐通风量的计算 (22)3.4.2种子培养基等其他无菌空气耗量 (22)3.4.3发酵车间高峰无菌空气消耗量： (22)3.4.4发酵车间年用气量： (22)4 纤维素酶发酵工段的设备选型与计算244.1发酵罐设备选型与计算244.1.1发酵罐的选型 (24)4.1.2生产能力、数量和容积的确定 (24)4.1.3发酵罐基本尺寸确定 (24)4.1.4冷却面积的计算 (25)4.1.5蛇管设计 (27)4.1.6壁厚计算 (29)4.1.7搅拌器计算 (29)4.1.8搅拌轴功率计算 (30)4.1.9接管设计 (32)4.1.10传动装置设计 (33)4.1.11发酵罐支座选择 (33)4.2种子罐的设备选型与计算334.2.1种子罐的选型 (33)4.2.2种子罐容积和数量确定 (33)4.2.3主要尺寸确定 (34)4.2.4冷却面积的计算 (34)4.2.5设备材料选择 (35)4.2.6壁厚计算 (35)4.2.7种子罐内部结构的工艺计算 (36)4.2.8支座选型 (38)4.3空气过滤器设备选型与计算384.3.1种子罐分过滤器 (38)4.3.2发酵罐分过滤器 (39)4.4无菌空气制备工艺设备选型与计算404.4.1工艺流程 (40)4.4.2空气状态的确定 (41)4.4.4储罐 (41)4.4.5一级冷却装置 (42)4.4.6旋风分离器 (47)4.4.8丝网除雾器 (50)4.4.9加热器 (50)4.4.10总过滤器 (52)4.5提取工段设备计算及选型534.5.1提取工段工艺流程 (53)4.5.2提取工段设备选型 (53)5 全厂布置的说明 555.1工厂总平面布置555.1.1总平面布置依据 (55)5.1.2.布置原则： (55)5.1.3布置说明 (55)5.1.4车间布置设计 (56)5.1.5设计遵循的原则： (56)5.1.6本设计的车间布置说明 (58)6 经济核算606.1投资估算606.1.1设备投资 (60)6.1.2土建投资 (60)6.1.3全厂总投资 (61)6.2成本计算616.2.1主要成本计算 (61)6.2.2煤耗 (61)6.2.3水、电耗 (61)6.2.4折旧费及其他费用 (62)6.2.5全厂人员安排 (62)6.2.6全厂每年销售成本 (62)6.2.6全年净收入 (63)7 结论64参考文献65附录68英语翻译76英文原文76中文译文841 绪论1.1纤维素酶简介纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物,是地球上最为丰富的可再生性天然资源。

纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。

纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。

研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。

利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。

但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。

二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。

其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。

迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。

纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。

微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。

关键词:诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。

微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。

作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。

目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。

1 物理诱变1.1紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。

紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。

二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。

马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。

顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。

紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。

1.2电离辐射γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。

其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。

高产菌株选育方法
高产菌株的选育方法主要包括自然选育法、基因诱变法、杂交育种法等。

1.自然选育法：利用自然环境中的微生物资源，通过自然进化选择出具有
优良性状的菌株。

这种方法虽然简单易行，但效率较低。

2.基因诱变法：通过物理、化学或生物等方法处理微生物，使其基因发生
突变，然后从中选择具有优良性状的突变株。

这种方法具有高效、快速的特点，但突变的不定向性（而非定位性）使得通常需要处理大量材
料。

3.杂交育种法：通过将两个或多个菌株进行杂交，然后从中选择具有优良
性状的杂交后代。

这种方法的关键在于找到合适的杂交亲本和杂交方
式。

此外，随着生物技术的不断发展，基因工程等新技术也被广泛应用于高产菌株的选育中。

例如，可以通过基因敲除、基因插入、基因修饰等技术对微生物的基因进行改造，以获得具有优良性状的高产菌株。

以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或论文获取更准确的信息。