高产纤维素酶菌株的诱变育种

紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。

而我国由于受人口多、耕地少的双重制约，粮食供应形势尤为严峻。

因此，我国畜牧业要稳定持久发展，就必须减少对粮食的依赖[1]。

手段 ， 提高产纤维素酶菌株的酶活 ， 再从 酶活较高 的诱 变菌株 出发 ， 寻找 出优化 的培养基配方。
１ 材料与方法
１ ． １ 标准葡萄糖溶液（ ．ｍ ／ ） ．１ ３． ０２ ｇ ｍＬ
１ 材料 与试剂 ． １ 绿色木霉 （ ｒ ｈ ｄｒ ａ ｉｄ ） 一 纤维素酶高产 Ｔｉ ｏ ｅ ｒ ｅ Ｄ ２ ｃ ｍ ｖｉ
发 酵中研 究了不 同麸皮稻草比例 、 培养基含水量、 氮源种类 、 无机 盐、 面活性 剂、 表 起始ｐ 因素对 茵株产酶活 力的 Ｈ等
影响 。 以上单 因素试验和正 交试验， 通过 得到优化 的培养基配方为： 麸皮３ ， 稻草５ ，Ｎ ｓ ． ， － ．ｍ 。 ｇ （Ｈ Ｘ ｏ ０ ４ ／１ ８ Ｌ ｇ ２ ｇ ５２
关键词 ： 色木霉 ； 绿 诱变育种； 固态发 酵； 纤维素酶
Ｓ ｒ ｉ ｎ ａ ｉ ｎ ｎ Ｓ ｌｄ ｔ ｔ ｒ ｅ ｔ ｔｏ ｆＣｅｌ ａ ｅ ｔ ａ ｎ Ｍ ｔ ｔｏ ａ ｄ ｏ ｉ －ｓａ ｅ Ｆｅ ｍ ｎ ａ ｉ ｎ Ｏ ｌ ｕｌｓ ＣＨＥＮ Ｔａ ｏ，ＸＵ ｎ Ｙａ
超净 台 ： 苏净集 团安泰公 司 ； 电子分 析天平 ： 梅特
勒一 托利多仪器 （ 海） 上 有限公 司 ； 冰箱 ： 青岛海尔集 团 ； Ｐ Ｓ２Ｔ Ｈ 一Ｓ 数显 酸度计 ：上海天 达仪器 设备有 限公 司 ； ７２ ２型分 光光度计 ： 上海精 密科 学仪器有 限公 司 ； 自动 蒸汽消毒锅 ： 无锡市启蒙生 物技 术研究所 ；Ｋ ８ 型电 Ｄ 一Ｄ
ｏｅ ｒｄ ｃ ｇ ｕａｔ Ｚ ２ ａ ｔ ｎ ｄｒｍａａ ｏ ｔ ｙ ｔ ｉ（ｒ ｈ ｄｒ ａ ｉｄ － ）ｈｏ ｇ ｕａｅｅｉ ｖｒ ｏｕ ｉ ｔ － ｓｂａ ｅ ｏ ｌ ｒ ｏ ｒ ｎＴｉ ｏ ｅｍ ｒ ｅ ２ ｔ ｕｈ ｔ ｎ ｓ ｐ ｎ ｍ ｎ ＷＬ ｗ ｏ ｉ ｆ ｂ ａ ｒ ｓａ ｃ ｖｉ Ｄ ｒ ｍ ｇ ｓ ｏｍｉ ｏ ａｅ ｎ Ｖ Ｔ ｅ ｃ ｖｙｏｃｌ ｌｓ ｗ ｓｎｒａｅ ｏ ０ ｘ ０ ａ ｇ ｃｌ ｌ ｅ ｓ ｒ ｅｉｍ）ｏ ｆ ｃ ｗ ｖ ｄ ．ｈ ｔ ｉ ｌ ａｅ ａ ｃｅｓｄ ｍ２ ７ １ ｋｔ （ａｃ ａ ｄａ ｄ ｍ ｄｕ ｔ ｒ ａ Ｕ ａ ｉｔ ｆｅｕ ｉ ｒ ｆ ／ ｕ ｔ ｙ

纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。

纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。

研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。

利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。

但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。

二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。

其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。

迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。

纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。

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５４． ８ ． — —
江苏农业科学
２ １ 年第 ３ ０１ ９卷第 ６期
蒋倩婷 ， 宋
斌， 闰文娟．产纤维素酶菌株选 育技术研 究进展［ ］ Ｊ ．江苏农业科 学，０ １３ （ ）５４— ８ ２ １ ，９ ６ ：８ ５ ７
产纤 维素酶菌株选育技术研究进展
蒋倩 婷 ，宋 斌 ，闰文娟
株 选 育 技 术 的研 究 进 展 。产 纤 维 素 酶 菌株 的选 育 技 术 一般 有
发菌株 ， 经过紫外线 、 亚硝基胍 、 硫酸二乙酯复合诱变处理 ， 选 育 出 １株纤维素酶活性显著提高 的突变株 ， 该菌株产 Ｃ Ｃ活 Ｍ
力在适当条件下为 出发菌株的 １５ ５ 。 ４ ．％
等， 所得到 的融合子 Ｃ ａｅ活性比亲本高 １ ＭＣ ｓ 倍 。
国内在纤维 素酶微生物原生质体制备 、 再生 、 融合方 面也
都进行 了探 索。林英 等研 究了绿色木霉 Ｆ ６ ２４的原生质体形
成条件 ， 结果表 明， 制备原生质体 的最佳条件 为 ： 菌丝菌龄为 １ ～ ０ｈ 用溶 菌酶 ：蜗牛 酶 ＝３： （ ｇｍＬ 的混 合 酶， ８ ２ ， ３ ｍ／ ） 以 ０ ６ｍ ｌＬＮ Ｃ 渗透压稳定剂的磷酸缓冲系统最好 ， ３ ． ｏ ａ １ ／ 在 ２℃
３ 基 因工 程 技 术
出发 菌株全部 的纤维素酶 ， 因此所 获得 的酶一般 是纤维素酶 复合体 的单个多肽组分 ， 具有 １ ～２种纤维素酶功 能 ， 不足 以
彻底 降解纤维素 ； 因工程纤维素酶缺乏纤维素结合 因子 ， 基 不 能水解结 晶态 的纤维素 ； 因工程 纤维素酶也不 能克服木质 基
素酶作用机制和构建高效纤 维素分解 菌株开辟 了新途径 ， 对扩 大原料来源 、 高生产效率 、 提 降低生产成本都具 有重要 的

制 。木霉 ，特别 是里 氏木霉 被 认 为整 ｐ ５ ０～ ｐ ６ ０ Ｈ ． Ｈ ． ，然 后 经 ０． １ ａ ０ ｎ高压 灭 菌后 备 用 。 ，２ｍｉ １ １３ 培养 方 法 ．． 保 藏菌 种 接 种 到 Ｐ Ａ 斜 面 进 行 活 化 培 养 ，经 表 Ｄ 面皿 稀 释 或划 线分 离 纯化 。并经 三 角 瓶摇 瓶筛 选 ，选 育 出具 有较 高 活力 的菌株 作 为 出发 菌株 。其 培 养 温度 ２ ℃ ，初始 ｐ ５ ０ Ｈ ．， 固 体 表 面 培 养 时 间 ７ ８ Ｈ ． ～ｐ ６０
（Ｕ／ ）来 表 示 。 Ｉ ｍＥ １ ３ 抗 分 解代谢 阻遏 的 突 变株 的选 育过 程 ． １ ３ １ 诱 变处 理 过程 ．．
纤 维 素物 质 的酶 促水 解 具 有 良好 的应 用 前景 。但
是 ，目前所存在的主要问题是酶解效率不高。为提高 纤维素酶解 的效率 ，多采用选育高产纤维素酶菌种和 改变纤维材料的结构 ，提高对酶的敏感性的方法 。选 育优 良菌种是提高纤 维素酶活力的关键 。通常，从 自 然界 分 离筛 选 的野 生 型菌 株 其产 酶 能力 比较 低 。为提 高纤维素酶 活力 ，诱 变育 种是一 种有效 的方法 。 目
基础。
天～１ 天 ，液体培养 ６ ～８ 。 ０ 天 天
１ ２ 分析 方 法 ．
还 原糖 测 定 ：取 上清 液 ，按 照 Ｍｉｅ 方 法 ，使 用 ｌｒ ｌ ＤｉＳ试 剂 测定 还 原 糖 的含 量 。 以葡 萄糖作 为标 准 。 Ｎ 纤 维素 酶 活力 测定 ：采 用 Ｍａ ｄｌ方 法来 测 定 滤 ｎｅ ｓ 纸 酶 活 （ ｉｅ ａｅ ｔ ｉ ，简 称 为 Ｆ Ａ）和 Ｃ ＦｌｒＰｐｒ ｉ ｔ ｔ Ａｃ ｖ ｙ Ｐ ＭＣ 酶 活 （ ＩＣ’ｅ） 其 酶 活 力 单 位 用 国 际 单 位 ＣＶ ａ 。 Ｉ ｓ

微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。

关键词:诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。

微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。

作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。

目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。

1 物理诱变1.1紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。

紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。

二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。

马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。

顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。

紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。

1.2电离辐射γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。

其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。

富集培养→纯种分离→性能测定。
（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是
从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养
嗜盐菌的菌样应从 海滩等高盐 环境采集。
（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境
条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培
养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为 的
3、操N作aC：l溶液作用：刚漂果洗红作，用以—免—出洗现去的与透纤明维圈素不结够合清不晰牢。的 方法1：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。 方法2：在倒平板时就加入刚果红。
染色法
优点
缺点
这两种方法各有哪些优点与不足？
颜色反应基本 操作繁琐。
方法1 上是纤维素分 刚果红会使菌落之间发生
(后置染色法） 解菌的作用 混杂。
发酵产纤维素酶实验 液体发酵 固体发酵
2、纤维素酶的测定方法:
对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖含量进行定量测定。
课堂小结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样 验 选择培养 设 计 纯化培养
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
为什么？
微生物大量繁殖
为什么选择培养能够“浓缩” 所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够 适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖， 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖 被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养 后的培养基进行等比稀释101～107倍。

（ｅ ａｏａ ｒ ｅｍ ｎ ｔ ｎＥ ｇｎ ｅ ｎ Ｍｉｉｒ Ｅ ｕａｉ ， ｏｅｅｏ Ｂｏ ｎｉ ｅｉ ， ｕ ｅ Ｕ ｉ ｒ ｏ Ｋ ｙＬｂ ｒｔ ｙｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｎ ｉ ｒ ｇ（ ｎ ｔ ｏ ｄ ｃｔ ｎ ｏ ｆＦ ａｏ ｅｉ ｓｙ ｆ ｏ ［Ｃｌ ｇ ｉ ｇｎ ｒ Ｈ ｂｉ ｎｖ ｓ ｆ ｌ ｆ ｅ ｅ ｎ ｇ ｅ
ｄ ｉ ３ ６／ｉ ｎ１７ － ０ Ｘ２ １．１ ０ ５ ｏ：ｍ．９９ ．ｓ． ４ ５ ６ ． ００ － ０ ｉｓ ６ ０
丢糟 ，是在 固态 发 酵法 酿造 白酒 时 入窖 回糟 蒸 酒后 的酒醅 。 由于 丢糟含 有难 于消 化 的稻壳 ， 粗纤 维
素 的酶解 是 一个 复 杂 的过 程 ，其 真正 的酶解 机 制还 不 完全 清楚团 。 从 自然 中分 离 出 的纤 维 素 酶生产 菌纤维 素 酶活 力 一直 不 高 ， 了最 大 限度 的利 用丢 糟 中的 纤维 素 ， 为
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ Ｍ ｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｆＨｉ ｈ Ｃｅｌ ｌ ｓ ｔ ｉｙ Ｓ ｒ ｉ ｃ ｅ ｎ ｎ ｎ ｔ ｇ ｎ ｓｓｏ ｇ ｌ ａ ｅ Ａｃｉ ｔ ｔ ａ ｎ ｕ ｖ
Ｆ Ｎ ｈｎ －ｉｇ Ｙ Ｎ ａ－ ａ ， Ｉ Ｎ Ｚ ｉｗ ｉＬ ｉ － ｉｎ ， ＨＥ ｏ ｂｎ Ａ Ｇ Ｓ ａ ｇ ｌ ， Ａ Ｇ Ｄ ｎ ｄ ｎ Ｑ Ａ ｈ－ ｅ， Ｉ ａ ｑａ ｇ Ｃ Ｎ Ｍａ－ ｉ ｎ Ｘ ｏ
ｍ ｔ ｅｅｉ Ｔ ｅＣ ｎｙ ｃ ｖ ｙＷ ３２９ ｕｇｄｙｍ ｄｕ ｔｅＦ Ａ ｅ ｚｍｅａｔ ｉ Ｗ ０ ．１ ／ ｒ ｄｕ ｕａ ｎｓ ． ｈ ＭＣ ｅｚｍｅａｔ ｉ ａ １３ ． ／ ｒ ｅｉｍ、 Ｐ ｎｙ ｃ ｖ ｇ ｓ ｉｔ ｓ ｏ ｈ ｉ ￣ ａ ３ １ Ｕｇｄｙｍｅｉｍ ｓ ６

纤维 素酶在 饲 料 、 酿造 、 食 加 工 、 汁 与 蔬 菜 粮 果 加工 、 纺织 等各 个方 面都具 有 重要 的用途 。近 年来 ， 随着 能源和 环境 问题 日益 严 峻 ， 用 纤 维 素 酶 降解 利 秸 秆原 料生 产 燃 料 乙醇 新 型 能源 ＿ 、 １ 利用 纤 维 素 酶 ］ 辅 助秸秆还 田＿ 等 命 题 也 日益 受 到 关 注 。然 而 ， ２ 目 前纤 维素酶 产酶 菌株 的 活力 还 较 低 ， 致其 生 产 成 导 本过 高 ， 制 了其 广泛 而有效 的应 用 。 因此 ， 育高 限 选 产的、 酶性 质优 良的纤 维 素 酶产 酶 菌 株 始终 是 人 们 关注 的热点 。
优 ） 曲 霉 属 （ ｐ ｒ ｉ ｕ ） 青 霉 属 （ ｎｃｌ ｕ ， Ⅱ、 Ａｓ ｅｇ ｌ ｓ 和 ｌ Ｐｅｉｉｌ ｍ） ｉ
２ 纤维素 酶产 生茵 的遗传 改 良
２１ ． 理 化 诱 变 育 种
从 自然 界 中直 接 分 离 出 来 的 里 氏 木 霉 产 酶 菌 株， 产酶 性 能 一 般 较 差 ， 须 要 进 行 菌 种 的 遗 传 改 必
策 略 在 纤 维 素 酶 菌株 遗 传 改 良方 面 的 应 用 ， 针 对 获 得 高 产 、 系 合 理 、 性 质 优 良 的 纤 维 素 酶 生 并 酶 酶 产 菌 株 提 出 了可 行 的 育 种 策略 。 关 键 词 ：纤 维 素 酶 ；里 氏木 霉 ； 传 改 良 遗 中 图 分 类 号 ：Ｑ８ ４ １ 文献标 识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１０ —３ ６ （０ ８ ０ ０ ０ ０ ０ ４ ２ ８ ２ ０ ） ８— ０ ５— ３
胞 壁光 滑 ， 生孢 子 梗 由菌丝 直 立 生 出 ， 色 ， 枝 分 无 分 多， 对生 或互 生二 至 三 级 分枝 ， 体像 树 枝 ； 枝 与 整 分

Байду номын сангаас
摘要： 利用 紫外线对米 曲霉原生 质体进行诱 变 ， 获得 １株 高产纤维 素酶 的 ３号 突变 株 ， 其纤维 素 酶活较 出发株 提高 了 ２ ４ ．９倍 ， 同时 研究 表 明 ， 机 盐 Ｍｇ￣４和 （ ４２０ 对 ３号 菌株 产 纤维 素 酶有 促 进作 无 Ｓ） ＮＨ ）Ｓ ４
用。
均 为 豆 汁 培养 基 ； 离 纯 化 、 筛 培 养 基 组 成 为 ： 分 初
Ｋ Ｈ Ｏ ｇ Ｋ １ ．ｇ， Ｓ ‘ Ｈ２ ．ｇ Ｆ Ｓ ４ ２ Ｐ ４１ ， Ｃ ５ Ｍｇ ０４ ７ ０ ０ ５ ， ｅＯ ・ ０ ７ Ｏ ０．１ｇ 蔗糖 ３ ， 脂 １ － ２ ， ５ ０ｍｌ Ｈ１ ０ ， ０ｇ 琼 ５ ０ｇ 水 ０ ，
表 １ 出发 菌株 生长情 况及产酶酶活 的比较
２ 菌丝 培养 。取 生 长 ７ ） ２ ｈ的 Ａ ０—６菌 株 斜 面 制 备菌悬 液 ， 将孢 子悬 液 点 种 于 表 面 覆 有 无 菌 玻 璃 纸 的菌丝 生 长培 养 基 上 ， 每皿 ０ ３ ． ，０ 培 ． ～０ ５ｍｌ３ ℃ 养 １ 。 ６ｈ ‘ ３ 原生 质体 制备 。取 纤维 素 酶 ０ ２ｇ ５ ， ） ． ／ ０ｍｌ蜗
牛酶 ０ ２ ｇ ５ ， 菌 酶 ０ ３ｇ ５ ， ． ｌＬ ． ／ ０ｍｌ溶 ． ／ ０ ｍｌ０ ７ｍｏ／
Ｎａ ｌ 容 ， Ｃ定 Ｇ６漏 斗过 滤 。取 无 菌平 皿 ， 皿 装 ８ｍｌ 每 混 和酶 液 ， 下 ３张 玻 璃 纸 上 的 菌 丝 ， ３ ℃ 下 酶 洗 于 ０ 解 ２ ０ｍｉ。 相差 显 微 镜 观 察 有 原 生 质 体 形 成 后 ， １ ｎ
维素 酶 的作用 愈来 愈受 到研 究者 们 的关 注 。纤 维素 酶是 降解纤 维 素 成 为 葡 萄 糖 的 一 组 酶 的 总 称 ， 利 在

产纤维素酶菌株的诱变育种一、实验目的：掌握紫外线诱变选育产纤维素酶产生菌的一般方法二、实验内容：最佳诱变剂量的确定：出发菌株的制备；诱变条件选择；稀释涂布并计算致死率。

在最佳诱变剂量下选育发生纤维素酶产量发生正突变的菌株。

三、实验要求：注意紫外诱变菌种选育的操作要点，防止光修复的产生，掌握筛选正突变的实验方法，并绘制时间和致死率之间的关系。

四、实验原理本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种五、实验材料及器材：纤维素产生菌紫外线灯三角瓶 PDA平板镜头纸平板培养皿 pH = 7. 0 的磷酸缓冲液和pH = 4. 4 的醋酸缓冲液玻璃珠黑纸恒温摇床涂布器六、实验步骤：1、孢子悬液的制备用pH = 7. 0 的磷酸缓冲液和pH = 4. 4 的醋酸缓冲液分别冲洗下斜面孢子,倒入装有玻璃珠的三角瓶中, 28 ℃下振荡30 min. 用血球计数板计数, 并稀释孢子浓度为1 ×10^9 ～5×10^9个/ L.2、在距功率15 W 的紫外线灯30 cm 处,将产纤维素酶菌株的孢子悬浮液分别照射4 min、6 min、8 min ,各涂3 个平皿,每个平皿接菌液0. 2 mL ,均匀涂布于平皿培养基.3、取未经紫外线处理的菌液,稀释至同样的浓度,作为对照,记为P.4、将上述平皿编号后用黑纸包好,置于30 ℃温箱,恒温培养72 h 后,进行菌落计数.5、根据对照平皿上的cfu 数,计算出每毫升菌液中的cfu 数,并计算出各皿的致死率6、实验重复3 次,结果取其平均值,并选取纤维素水解圈与菌落直径比值最大的菌落,编号后转接于斜面。

7、时间与致死率图像的绘制：将菌悬液在UV下照射不同时间5、10、15、20、25min，按不同稀释梯度涂布接种于平板初筛培养基。

加大照射时间，测定每个时间点的致死率，绘制时间与致死率关系的图像。

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案： 纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱诱变出高产纤维素酶的菌种。

变出高产纤维素酶的菌种。

实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×200~300×10nm10nm ，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

材料和器皿：（1） 菌种：木霉单孢子 （2） 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。

（3） 器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml ）,150ml 三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。

（4） 仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。

实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：单孢子悬液制备： 用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散摇床上震荡分散30min 30min 30min，，4 4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。

层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。

层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。

稀释对照菌液（未照射菌液）稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成10-1~10-610-1~10-610-1~10-6，，然后从然后从10-5,10-610-5,10-6两管中各吸取两管中各吸取0.1ml 0.1ml 0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于3232度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，第二第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。

产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。

这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。

在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。

菌株需要1。

内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。

2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。

随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。

只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。

就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。

只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。

从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。

使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。

刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。

14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重，称取 0.1g 烘好的葡萄糖，溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液：冰 醋酸 6mL，蒸馏水定容至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ；B 液 ： 称 取 8.2g 醋 酸 钠 ， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸钠溶液；以 A：B=4：6 的比 例混合，低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ，30℃ 浸 提 6min，纱 布 过 滤 ，3000r/min 15min，上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ，再 各 加 2mL DNS 试 剂 ，沸 水 浴 加 热 5min，流水冷却，蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm～600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷（总第 155 期）
Food and Fermentation Technology
第 46 卷（第 1 期） Vol.46，No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲，杨丹丹，钱志伟，李小强，陈茂彬*
（发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉 430068）
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后， 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min，取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL，充分混匀。 在选定波长下，以 1 号试管溶 液作为空白对照， 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的 OD 值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx，CMC 酶活)

微 生物 学 杂 志 ２１年５ ００ 月第３ 卷第３ ＪＵ Ｎ Ｌ Ｆ ＩＲ ＢＯＯ ＹＭ ｙ００ ｏ３ Ｎ． ０ 期 Ｏ Ｒ Ａ Ｃ ＯＩＬ Ｇ ａ ２１ Ｖ１０ ｏ ＯＭ ． ３
５ ９
斜 卧 青 霉 纤 维 素 酶 和 木 聚 糖 酶 高 产 菌 株 的 选 育
刘新 育 ， 梅 贞，宋安 东 ，刘 亮伟 ，陈红 歌 靖
Ａ５ ０． Ｔｈ ｐｔｍｕ ｍｅ ｉ ｍ ｏ ｔａ ｎ Ｎｏ ６ ｓｒ ｉ ｓ ｃ ｍｐ ｅ ｆｂｒ ｅ ｏ ｉ ｍ ｄ ｕ ｆｒ ｓｒ ｉ ． ｔａｎ ｗａ ｏ ｏｓ ｄ ｏ ａｎ７％ ａ ｄ ｇｕ ｏ ｅ ０． ｎ ｌｃ ｓ １％ ． Ｕｎ ｒ ｔ ｓ ｃ ｎ ｉ ｄｅ ｈｉ ｏ ｄ —
Ｋ ｅ ｗ ｏ ｄｓ Ｐｅ ｉｉｌｕ ｄｅ ｕ ｅ ｓ；ｃ ｌｕ ａ ｅ；ｘ ｌｎａ ｅ； ｍｕ ａｉｎ ｙ ｒ ｎｃｌｉ ｍ ｃ ｍｂ ｎ ｅｌ ｌｓ ｙａ ｓ ｔｔ ｏ
天然 纤维 素原 料是地 球上 最 丰 富 的可再 生 资 源 ， 目前被 利用 的 只有 １ ％。纤 维素 大 多 被半 但 １ 纤维素包 裹 ， 其降解 必然受 到半 纤维 素 （ 大多 是木 聚糖 ） 的制约 ， 以纤维 素酶 和木聚糖 酶两 种 酶 的 所 联合使 用 ， 泛应 用到造 纸 、 品加工 、 织 、 物 广 食 纺 动
Ａｂｓｒ ｔ Ｃｅｌ ｌｓ ｉｈ— ｉｌ ｎｇＰｅ ｃｌｉｍ ｅ ｕ ｂ ｎ Ａ５ ｓ ｕ ｅ ｓａ ｓａｔｎｇｓｒ ｉ ｎ ｔ ｉ ｔ ｄ ｎ ｂｔｉ ｄ ｔａｃ ｌｕａ ｅ ｈｇ ｙｅｄｉ ｎｉｉｌｕ ｄ ｃ ｍ ｅ ｓ ０ ｗａ ｓ ｄ ａ ｔ ｒｉ ｔａｎ ｉ ｈ ｓｓｕ ｙ ａ ｄ ｏ ａｎｅ ｍ ｕａ ｔａｎ Ｎｏ ６ ｗｉｈ ｘ ｌ ｎ ｓ ｎｃｅ ｓ ｄ ｂｙ８ ｔｎｔｓｒ ｉ ． ｔ ｙａ ａ ｅ ｉ ｒａ ｅ ０％ ｗｉｈ ｕ ｈａ ｇｎｇＡ５ Ｓｃ ｌｕａｓ ｃｉ ｉｙｔ ｏ ｈ ＵＶ ｒ ａｍｅ ｆ ｔｏ ｔｃ ｎ ｉ ０’ ｅｌ ｌ ｅａ ｔｖｔ ｈｒｕｇ ｔｅ ｔ ｎｔｏ

Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔ ｈ ｅ ｆ ｕ ｎ ｇ ｕ ｓ Ｃ ｏ ｒ ｄ ｙ ｃ ｅ ｐ ｓ ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ ｅ ｏ ｆ山ｅ ｆ ａ ｍｏ ｕ ｓ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｌ ａ ｍｕ ｓ ｈ ｒ ｏ ｏ ｍ ａ ｎ ｄ ｉ ｆ ｂ ｉｎ ｆ ｏ ｌ ￣ｉ ｃ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｉ Ｓ
Ｊ ｕ １ ．
文 章 编 号 ：１ ６ ７ １ — ９ ６ ４ ６（ ２ ０ １ ３ ）０ ７ ａ 一 ０ ０ ０ ３ — ０ ４
高产 纤溶酶蛹 虫草菌株 的诱变育种
王 汉峰 １ ， ２ ， ． 刘晓 兰 １ Ｉ ２ ，郑喜群 ， 一 ，郭涵鑫 １ ， ２
（ １ ． 齐齐哈尔大学 食 品与生物工程学 院，黑龙江 齐齐哈尔 １ ６ １ ０ ０ ６ ；
２ ． 农 产品加工黑龙 江省普通高校重点试验室 ，黑龙江 齐齐 哈尔 １ ６ １ ０ ０ ６ ）
摘 要 ：蛹虫 草中含有多种生理活性物质 ，是 中国名贵 中药 材之一 。前期试验发 现其发酵液 中含有纤溶 酶 ，具有开发 成一种 新型溶栓药 物的价值 。以试 验室保存 的 ８株蛹虫 草为试验菌株 ，以纤溶 酶酶活 为指 标 ，进行 液体深层培养 ，
关键词 ：蛹虫草 ；纤溶酶 ；抗制霉素突变株 ；紫外诱变 中 图分 类号 ：Ｑ ９ ３ 文献 标 志 码 ：Ａ ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ １ — ９ ４６ ６ （ Ｘ） ． ２ ０ １ ３ ． ０ ７ ． ０ ０ ２
Ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃ ｏ ｒ ｄ ｙ ｃ ｅ ｐ ｓ Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｉ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｈ ｉ ｇ ｈ Ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ ｏ ｆ Ｆ ｉ ｂ ｒ ｉ ｎ ０ ｌ ｖ ｔ ｉ ｃ Ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ

专题九发酵工程(1)泡菜、果酒和果醋的制备原理、过程和条件控制。

(2)微生物培养基的配制和无菌技术。

(3)微生物的选择培养和计数。

(4)发酵工程及其基本环节。

1.判断有关发酵工程应用说法的正误(1)腐乳制作利用了毛霉等微生物产生的蛋白酶和脂肪酶。

(√)(2)在制作果醋时，如果条件适宜，醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成乙酸。

(√)(3)果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度。

(×)(4)制作泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用。

(×)(5)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件。

(×)(6)发酵工程的产品主要包括微生物的代谢产物、酶及菌体本身。

(√)(7)在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母，可以加速发酵过程，缩短生产周期。

(√)2.判断有关微生物培养与应用说法的正误(1)在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。

(×)(2)检测土壤中细菌总数实验操作中，确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数。

(×)(3)虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。

(√)(4)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源又是氮源。

(√)(5)观察细菌培养的实验时，最好是在另一块平板上接种无菌水作为对照实验。

(√)(6)平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法中菌液要充分地稀释。

(√)(7)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。

(×)(8)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法，也能用平板划线法。

(×)(9)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。

(×)(10)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(×)1.果酒发酵时，装入发酵瓶要留有大约1/3的空间，原因是。

提示为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气，防止发酵时汁液溢出2.某同学在通过发酵制作果酒时，发现在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是。