高通量测序最新进展

高通量测序最新进展--------综合不同的测序技术进入21世纪后，以Roche 454、Illumina Solexa和ABI SOLiD为代表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你追我赶的技术比拼高潮。

2010年，Illunima和ABI先后发布新款测序仪，改进了原有机型，测序通量不断提升，测序成本不断降低，现在已经进入了数千美元测一个人全基因组的时代。

Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99%。

一次运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。

Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术"DNA簇"和"可逆性末端终结（reversible terminator）"，实现自动化样本制备和大规模并行测序。

Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收购了Solexa。

2010年初，Illumina将其第二代测序仪Genome Analyzer IIx升级到HiSeq 2000。

目前最新款SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidicFlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通道（run lane）。

每条lane都能运行相对独立的测序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl 测序平台极具灵活性。

最大测序读长为75nt，同样支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。

单次运行能得到的最大数据量为300Gb （使用最新设计的nanobeads）。

测序的系统准确性能达到99.99%。

技术推进科学研究的发展。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。

比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。

在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。

在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

第三代测序：1. Helicos公司Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。

用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。

然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。

将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。

用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。

经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。

Heliscope的读取长度约为30-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。

2. Pacific Biosciences公司Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。

SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm 的金属片。

将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。

与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。

当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。

此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（微秒级）相比会很长，所以信号强度会很大。

其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。

在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。

3. Oxford Nanopore Technologies公司Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的技术。

他们设计了一种以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。

用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。

一、测序技术总结与展望第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。

第二代测序技术中，454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。

Solexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。

Solexa双末端测序(paired-end sequencing)可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。

SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SN P检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。

第三代测序技术目前正在研发阶段，尚未正式投入使用。

高通量是第二代和第三代测序技术的共同特点。

由于这些测序技术一次可获得上百万条、甚至几百万条序列信息，因此可对某一组织、某一时间表达的所有mRNA进行序列测定，故又被称为深度测序[32]。

由于使用高通量测序技术可以实现对不同组织mRNA表达差异进行检测，通过与基因组进行比较可以确定组织特异表达的基因，因此具有取代“基因芯片”技术的态势。

由于基因芯片的检测范围取决于芯片上探针的信息，因此只能检测人们已知序列的特征，缺乏发现寻找新基因的能力，而高通量测序则能够很好地弥补基因芯片这方面的不足。

但就目前而言，高通量测序技术建立的时间还很短，技术不是很成熟，其信息储备量也很有限；而基因芯片技术已经发展了近16年，其实验技术及后期数据分析理论已经很成熟很完备，也积累了庞大的公共数据库，因此短时间内基因芯片技术还会占据主导优势。

但相信在不久的将来，高通量测序技术将会越来越成熟并得到更加广泛的应用。

Genome Analyzer技术的基本原理：1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。

另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥(bridge) “。

反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。

DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。

3. 测序Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing BySynthesis）的原理。

加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。

这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。

此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。

之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。

如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。

这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。

目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。

读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。

4. 数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。

Genome Analyzer系统之所以如此畅销，关键在于其技术上的优势。

1. 可扩展的超高通量Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。

这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。

到今年底，通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。

2. 需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。

这也是很多研究人员所考虑的因素。

3. 简单、快速、自动化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。

即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。

制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。

Cluster Station可以说是Genome Analyzer的核心。

由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5小时之内（30分钟手工操作）完成。

这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。

快速的实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化步移降低了项目的时间和费用。

4. 新颖的测序化学技术Genome Analyzer通过合成测序来支持大规模并行测序。

利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。

由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的误差。

5. 单个或配对末端支持Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。

文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间。

制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6个小时，只有3个小时需要手工操作。

2×50个碱基或更长的读长增加了比对基因组的能力，并拓展了在其他方面的应用。

然而，精明的用户更看重的是性价比，这也是他们选择Illumina的重要原因。