奶牛结核病的诊断

２０１９年第１１期（总第３６６期）畜禽业疫病防治奶牛结核病的诊断和防治赵祖凤（昭通市职业教育中心，云南昭通６５７０００）摘　要：结核病是奶牛感染率较高的一种慢性消耗性传染病，对奶牛业的危害很大，严重影响到奶牛场的经济效益。

论述了奶牛结核病的诊断和防治，以期对奶牛生产起指导作用。

关键词：奶牛；结核病；防治ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０１９．１１．０７３　引言奶牛结核病多呈地区性散发和流行，对奶牛业的危害很大。

本文综述奶牛结核病的诊断和防治方法，供养殖户参考。

诊断方法（１）临床症状诊断。

当发现牛不明原因的逐渐消瘦、咳嗽、肺部异常、慢性乳腺炎、顽固性持续腹泻、体表淋巴结呈慢性肿胀等临床症状时，一般可怀疑为本病。

（２）病理变化诊断。

通过病理解剖发生多种器官、组织有特异性结核结节的病变时，可作初步诊断。

（３）细菌学诊断。

将采集的病料涂片，用抗酸染色后镜检，若发现被检病料中有呈红色的杆菌时，可作初步诊断。

但检出率不高，不作为结核病常规检疫方法。

（４）变态反应诊断。

结核菌素变态反应试验是我国结核病检疫的常规检疫方法，是最可靠最具有诊断意义的方法，即用牛型提纯结核菌素作皮内注射和点眼试验。

皮内注射后经７２ｈ判定反应，仔细观察局部有无热痛、红肿等，并用游标卡尺测量皮皱厚度。

局部有明显炎症反应，皮肤红肿皮厚差在４ｍｍ以上者即判为阳性；红肿不明显，皮厚差在２～４ｍｍ者判为疑似；无炎性反应，皮厚差在２ｍｍ以下者为阴性。

对于疑似反应的牛应立即在另一侧用同一剂量的牛型提纯结核菌素进行第２次皮内注射，再经７２ｈ后观察反应，凡判为疑似反应的牛，３０ｄ后需复检１次，如仍为疑似的牛只，经３０～４５ｄ再次复检，如仍为疑似者判为阳性；任何一种方法都无炎症反应者判为阴性反应。

　防治措施（１）定期检疫。

对健康牛群应加强检疫，每年春、秋季节定期进行一次结核菌素变态反应检查，发现阳性病牛要立即隔离，及时淘汰，且每隔３０～４５ｄ后检疫１次，若经再次复检仍为疑似反应者应判断为阳性病牛，若连续３次检疫为阴性者才认为是健康牛群，对健康牛群要加强饲养管理和预防，对受威胁的犊牛出生后１个月可进行卡介苗接种，以后接种１次／年。

BOVIGAMTM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒牛结核病的体外诊断试剂盒，仅限兽医诊断实验室使用一、简介牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种疾病，世界各国均有发生，在奶牛业中具有非常重要的地位。

在一些国家，某些奶牛群的总体发病率接近60-70％。

二、描述BOVIGAM TM 是一种牛结核病的体外快速诊断试剂盒，其原理基于血液T 淋巴细胞对牛结核分枝杆菌PPD 的细胞免疫反应。

结核菌素PPD 抗原递呈到全血组织培养物中的淋巴细胞后，感染牛结核分枝杆菌的细胞就能产生IFN-γ，并通过基于单克隆抗体的夹心ELISA 检测到。

未感染牛结核分枝杆菌的淋巴细胞不会产生IFN-γ，因此，γ-干扰素的检测与牛结核分枝杆菌感染相关。

BOVIGAM TM 在牛结核菌素皮肤试验后使用。

在皮肤试验检测出阴阳性结果后3-30天，可用γ-干扰素试验来确诊。

三、现场研究用澳大利亚、美国、爱尔兰、新西兰、意大利和西班牙的13 000头牛进行田间试验，结果表明BOVIGAM TM 在诊断牛结核病时更敏感，甚至能检出早期感染牛。

在USDA/ARS/国家动物疾病中心的家畜细菌病研究中心(美国爱荷华州Ames)，用20头对灭活牛结核分枝杆菌敏感的Hereford 食用牛进行了实验室对照研究。

比较了BOVIGAM TM 对美国PPD 和辉瑞澳大利亚PPD 的反应，表明不管用美国的PPD 还是用澳大利亚的PPD 刺激，所有牛都表现为阳性。

另外，新西兰的研究表明，试剂盒的特异性不受皮肤试验的影响，在尾根皱襞试验（CFT ）后3-30天使用时，本试剂盒比颈部皮肤试验（CCT ）更加敏感。

四、试剂盒组成试剂盒储存于2-8℃。

除酶标结合物外，所有试剂在使用前恢复至室温(22° ± 5°C)。

用完后立即放回2-8℃。

1.酶标板（包被γ-干扰素抗体） 2块96孔板 10块96孔板30块96孔板 可直接使用2.牛γ-干扰素阳性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解 3.牛γ-干扰素阴性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解 4.绿色稀释液（血浆稀释缓冲液，含0.01%硫柳汞）1×15mL 1×60mL 1×175mL可直接使用5.20×洗液（含0.01%的硫柳汞） 1×100mL 3×125mL 2×500mL 用去离子水或蒸馏水稀释6.100×酶标结合物（HRP 标记的抗牛γ-干扰素抗体，含0.01%的硫柳汞） 1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL冻干，用去离子水或蒸馏水重新溶解 7a.蓝色稀释液（5倍浓缩的酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞） N/A 1×25mL N/A用去离子水或蒸馏水稀释 7b.蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞） 1×30mL N/A2X175mL可直接使用8.底物缓冲液（含H 2O 2）1×30mL 1×125mL 2×175mL 可直接使用 9.100倍浓缩的显色剂溶液（含溶于DMSO的TMB ）1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL用底物缓冲液稀释10.终止液(0.5M H 2SO4) 1×15mL 1×75mL 1×175mL可直接使用广州市瑞品生物技术有限公司 广州市瑞品生物技术有限公司 五、试剂盒未提供的材料A. 采血1. 肝素锂真空管 每头动物1支2. 18号针头－1寸 每头动物1支3. 针管 每位采血人员2-3支B. 血液培养1. 无菌的5或10mL移液器 每头动物1根2. 无菌的24孔组织培养板 每8头动物1块3. 分装用的枪头（5mL） 每群动物3支4. 无菌的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.2) 每头动物100µL5. Bovigam牛型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支6. Bovigam禽型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支C. 收获血浆1. 100-1000 µL枪头 每头动物3支2. 用于储存血浆的1mL离心管(放在96孔板架上)和盖子 每30头动物1个架子D. 牛γ-干扰素酶免疫试验1. 12道移液器吸头 每头动物3支2. 各种规格的聚丙烯管、酶免疫试验的试剂反应槽和枪头实验仪器1. 37℃培养箱2. 精密可调移液器（1mL）3. 1mL、5mL、10mL的移液器4. 100mL、1L、2L的量筒5. 6L去离子水或蒸馏水6. 12道移液器（50µL-300µL）7. 微量振荡器（可选）8. 洗板机9. 酶标仪（必须含450nm和620-650nm的滤光片）六、试剂配制1. 抗原Bovigam试剂盒在美国已被批准用于牛结核病的诊断。

结核病是由结核杆菌引起的人畜共患慢性传染病，布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患慢性传染病。

这两种病的流行，不但影响到畜牧业的持续发展，而且严重威胁着人类的健康。

近几年来，汾阳市奶产品消费迅速增加，奶牛饲养规模也逐渐壮大，因不断引进外地品种，奶牛频繁交易，奶牛结核病、布鲁氏菌病的发生已初露端倪。

为确保销售鲜奶的品质和饮奶安全，2012年8月，汾阳市动物疫病预防控制中心对全市972头奶牛进行了“两病”检测，结果结核病检测出阳性4头，布病也检测出阳性2头。

现报告如下：1材料牛型提纯结核菌素由黑龙江生物制品一厂生产；灭菌生理盐水；游标卡尺；1mL 一次性注射器；6#×7mm 不锈钢针头；75%酒精；灭菌医用棉。

布鲁氏菌琥红平板凝集试验抗原、标准阳性血清、阴性血清，布鲁氏菌试管凝集试验抗原、标准阳性血清、阴性血清由青岛易邦生物工程有限公司生产；受检血清新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味；洁净的玻璃板，其上划分成4cm 2方格；微量单道移液器；一次性吸头。

2方法牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验方法按GB/T18645-2002标准操作。

布鲁氏菌病平板凝集试验和试管凝集试验方法按GB/T18646-2002标准操作。

3判定标准结核病检测采用牛提纯结核菌素皮内变态反应操作规程进行结果判定。

皮厚差≥4mm ，注射部位有肿胀、热痛等炎性反应为阳性；皮厚差2~3.9mm 疑似阳性，需复查；皮厚差＜2mm 为阴性。

布鲁氏菌病以琥红平板凝集试验进行初检，阳性和可疑反应重新采血作试管凝集试验，血清稀释度在1颐100以上，出现“++~++++”凝集现象时，受检血清判定为阳性。

4结果经检测，972头奶牛中确诊为结核病阳性的奶牛有4头，分别位于峪道河镇、杏花镇、三泉镇、冀村镇；布病阳性的奶牛有2头，分别位于峪道河镇、肖家庄乡。

检测结果见表1。

5小结与讨论对检出的6头阳性奶牛按照国家有关法律法规强制扑杀和深埋处理，对圈舍、用具等彻底消毒。

牛结核病是由牛结核分枝杆菌引起的人、畜和禽共患的一种慢性传染病，人结核的10％以上由牛分枝杆菌引起。

世界各国对结核病大多采取检疫净化的方法进行控制，皮内变态反应是世界动物卫生组织（OIE）唯一指定的检疫方法，其判断标准有三种：1、我国的国家标准注射方法：不论牛只大小，一律皮内注射0.1mL（20000 IU/ mL）的牛型提纯结核菌素，72h 后观察结果。

阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm 。

疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0 mm，同时小于4.0 mm ；阴性反应：无炎性反应，皮厚差在2.0 mm以下。

2、欧盟的对比PPD试验在注射牛型提纯结核菌素（注射方法、剂量同我国的标准）的同时，在牛的颈部另一侧对应部位（或在颈部同一侧，但两次注射的位置间隔大约为12～15cm），皮内注射禽型PPD（20000 IU/ mL） 0.1 mL，72h后观察结果。

阳性反应：牛型PPD反应阳性，且比禽型PPD反应大4mm以上；疑似反应：牛型PPD反应是阳性，并且牛型PPD反应仅比禽型PPD反应多1～4mm；阴性：牛型PPD反应是阳性或阴性，但其反应等于或小于禽反应。

3、世界动物卫生组织（OIE）判断标准仅用牛性结核菌素进行检疫，方法同中国国标，但判断标准较严：局部出现炎性反应，皮厚差≥2.0mm，判断为阳性；皮厚差<2.0mm判断为阴性。

综合来看，世界动物卫生组织（OIE）在牛结核变态反应判定标准较为严格。

欧盟比较法皮内变态反应是对传统的牛型PPD法的改进，能够区别被检动物是由牛型分枝杆菌感染还是由其它非典型分枝杆菌感染，可避免由于禽结核分支杆菌引起的非特异性反应，减少无害化处理损失，对于我国的奶牛结核病检疫净化具有一定的借鉴作用。

奶牛结核病检测方法奶牛结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可以影响奶牛的健康和生产能力，还可以通过食用患有结核病奶牛的牛奶和肉类传播给人类。

因此，对奶牛结核病进行及早的检测和防控非常重要。

下面将介绍几种常用的奶牛结核病检测方法。

一、皮内试验皮内试验是目前最常用和经济实用的奶牛结核病检测方法之一。

这种方法通过在奶牛的皮肤下注射结核菌抗原，观察注射部位是否产生特异性的变应反应来判断奶牛是否感染结核菌。

结果的判断是根据注射后48~72小时观察注射部位是否有明显的硬结和红肿，硬结直径大于10mm者为阳性反应，表明该奶牛可能感染有结核菌。

需要注意的是，皮内试验属于间接试验，存在一定的假阴性和假阳性的可能性，因此在实际应用中需要与其他检测方法相结合来判断奶牛结核病的感染情况。

二、血清学检测血清学检测是通过检测奶牛血液中特异性抗体的存在来诊断奶牛结核病。

常用的血清检测方法包括血液凝集试验、酶联免疫吸附试验和胶体金试验等。

这些方法的原理是将感染结核菌的奶牛的血清与结核菌抗原进行反应，然后通过不同的检测方法观察血清的凝集、发色等反应，判断是否存在结核菌的感染。

相比于皮内试验，血清学检测方法具有操作简单、准确性高等优点，但也存在着一定的假阳性和假阴性的可能性，因此也需要与其他方法相结合来判断奶牛结核病的感染情况。

三、结核菌培养结核菌培养是通过在适当的培养基中培养样本中的结核菌，然后观察菌落的生长情况和形态特征来判断奶牛是否感染结核菌。

这种方法是目前诊断结核病的“金标准”，对确定结核病感染的确诊具有重要意义。

但是，结核菌培养的过程需要较长时间，通常需要培养4-6周才能得到结果，因此不太适合作为常规的奶牛结核病筛查方法。

此外，结核菌培养的操作较为复杂，需要较高的实验室技术和设备条件。

四、核酸检测核酸检测是通过检测奶牛体内结核菌的核酸（基因）来判断是否感染结核菌。

这种方法的优点是操作简便、结果快速，对于早期结核病感染的检测具有较高的灵敏度和特异性。