下载文档原格式
手足口病的实验室检测及辅助诊断方法
郭根柱
【期刊名称】《中国社区医师》
【年(卷),期】2015(031)025
【摘要】目的:探讨手足口病的实验室检测以及相关辅助诊断方法.方法:收治手足口病患者32例,采用实时荧光PCR方法检测手足口病的病原菌,并与常规RT-PCR 方法检测结果进行比较.结果:肠道病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型为手足口病常见的病原体,两种检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:实时荧光PCR检测方法与常规RT-PCR方法检测吻合度较高,肠病毒71型可作为早期诊断手足口病的指标之一.
【总页数】2页(P114-115)
【作者】郭根柱
【作者单位】222023 江苏省连云港市海州区锦屏卫生院检验科
【正文语种】中文
【相关文献】
1.实时定量PCR检测流感嗜血杆菌感染实验室诊断方法的建立 [J], 蔚然;王良玉;高琦;胡文娟;窦海伟;向莉;辛德莉;郭东星
2.实验室常规检查在手足口病辅助诊断中的应用 [J], 叶迎宾;郭卫刚;章健;黄秀香
3.艾滋病病毒实验室诊断方法及患者检测指标 [J], 姚瑞霞
4.3种梅毒实验室诊断方法检测结果比较 [J], 张榕;汪照国;等
5.手足口病合并肺炎支原体感染患儿实验室指标检测的临床意义 [J], 胡妞
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析摘要】目的分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征。
方法收集2011年本地手足口病患者临床标本332份，进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定，采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。
根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71 VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。
结果 165份标本鉴定为EV71，分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%。
与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高。
亲缘进化树显示，本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支。
结论本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近，有共同进化的趋势，属于C4基因亚型的C4a进化分支，并存在多个传播链。
【关键词】肠道病毒71型基因特征遗传进化手足口病（hand，foot and mouth disease， HFMD）是由多种肠道病毒引起的，严重威胁儿童健康的全球性传染病。
临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹，伴有发热、咽痛、倦怠乏力等症状，个别重症患儿病情进展快，可发生死亡。
为全面了解本地区手足口病病原学分布的情况，对本市446份手足口病临床诊断标本进行检测，现将结果报告如下。
1 材料和方法1.1 标本来源2009～2010年各医院送检的HFMD临床诊断标本共332份，其中粪便、咽拭子、肛拭子、脑脊液、气管洗液标本各201、72、43、12、4份。
1.2 核酸提取和荧光定量RT-PCR检测采用QIAGEN Reansy Mini Kit试剂盒，操作步骤参照Rneasy Mini kit Handbook。
上海之江生物科技有限公司生产的肠道病毒71型荧光检测试剂盒和柯萨奇病毒A 组16型荧光检测试剂盒。
1.3 EV71 VP1基因扩增将检测为EV71阳性的病毒核酸进行全长VP1编码区的核苷酸序列测定和分析。
肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用吴菲菲;董敏;葛路遥;胡馨云;张程;张建华;江炳福;孟继鸿【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(000)006【摘要】Objective: To establish a specific immunofluorescence assay for identification of enterovirus 71 ( EV71 ) after isolation from cell culture and lay the foundation for EV 71 pathogen biology research and vaccine strains screening.Methods:Monoclonal antibodies (McAb) were prepared against EV71 VP1.An EV71-specific McAb and identified enteroviruses were used for establishment of an EV 71-specific immunoflurescence assay .The assay was applied for EV71 identification after virus isolation from clinical samples collected from patients with hand, foot and mouth disease( HFMD) at different areas of China .Results: Two McAbs, designated 3E12 and 5C1, against EV71 VP1 were obtained.The McAb 3E12 was EV71-specific.The immunofluorescence assay established based on 3E12 was identified to detect EV71 only.Other enterovirus strains such as coxsackievirus A 16 and ECHO virus 6 were not detected by theassay .Thirty-five virus strains were isolated with typical cytopathogenic effect of enterovirus in cell culture from 104 HFMD specimens .Twenty-nine isolated virus strains were identified as EV71 by the EV71-specific immunofluorescence assay , which was the same as the result tested by EV71 RT-PCR. Conclusion: The EV71-specific McAb is successfully prepared and used for establishment of the immunofluorescence assay with high sensitivity and specificity for identification of EV 71 isolated from cell culture .%目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定，为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。
不同方法检测肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的意义杜昆【摘要】Objective To investigate the significance of immunochromatographic assay (ICA ) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of anti-enterovirus 71 (EV71) IgM antibodyin hand-foot-mouth disease (HFMD) .Methods Serum samples from 135 children with HFMD and 44 cases of non-HFMD pa-tients were detectedfor EV71 IgM antibody by ICA and ELISA .Results In 135 cases withHFMD ,the positive rates of EV71 IgM antibody ,detected by ICA and ELISA ,were 21 .48% (29/135) and 20 .74% (27/135) respectively .In 44 cases of non-HFMD patients ,the positive rates were both 0 .00%(0/44) .Conclusion HFMD could be definitely di-agnosed when EV71 IgM antibody is positive ,but could not be eliminated when the EV71 IgM antibody is negative , when the diagnosis should be combined with clinical symptoms .%目的：研究免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肠道病毒71型（EV71）IgM 抗体在手足口病诊断中的意义。
肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定李小青;何威;段明月;李丹;冯媛【期刊名称】《临床和实验医学杂志》【年(卷),期】2014(000)016【摘要】目的采用分子克隆技术，构建肠道病毒71型（ EV71）VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体，诱导重组VP1融合蛋白表达。
方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA，进行一步法RT-PCR，扩增编码VP1蛋白的全长基因片段（891 bp），以pET32（a）为表达载体，构建重组表达质粒pET32（a）- VP1，转化E. coli. Rosseta感受态细胞，获得重组工程菌株。
经诱导培养，SDS-PAGE电泳，免疫印迹鉴定表达产物。
结果获得了含重组表达质粒pET32（ a）- VP1的正相阳性工程菌株，经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。
结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白，对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。
%Objective The aim of this study are to construct recombinant expression vector containing VP1 whole gene of enterovirus 71 (EV71)by DNA recombinant technology and to induce expression of VP1 fusion protein in E. coli. Methods The interested gene with total extracted from the serum of patients. These patients were infected by EV71 virus. We inserted it into pET32(a)expression vector to construct recombinant expression vector pET32(a)- VP1. The verified recombinants pET32( a)- VP1 were transformed into E. coli. Rossena to produce bacteria strain with positive recombinants,then the strain were analyzed with SDS - PAGE and immunoblotting to verify the expression product -- VP1 fusion protein.Results The positive bacteria containing the recombinant expressive vector pET28(a) - VP1 were constructed successfully, and high level expression of VP1 fusion protein was performed by inducing with IPTG. Conclusion It played an important role in investigating the pathogenesis of EV71 and developing vaccine in the future that the VP1 fusion protein of the positive strain with recombinant were expressed efficiently in E. coli system.【总页数】4页(P1314-1317)【作者】李小青;何威;段明月;李丹;冯媛【作者单位】西安交通大学医学院附属儿童医院儿科疾病研究所陕西西安710003;西安交通大学医学院附属儿童医院儿科疾病研究所陕西西安 710003;西安交通大学医学院附属儿童医院儿科疾病研究所陕西西安 710003;西安交通大学医学院附属儿童医院儿科疾病研究所陕西西安 710003;西安交通大学医学院附属儿童医院儿科疾病研究所陕西西安 710003【正文语种】中文【相关文献】1.肠道病毒71型重组VP2蛋白原核表达及初步鉴定 [J], 施静;朱冰;钟家禹;王长兵;许甜甜2.肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定 [J], 岳盈盈;李志会;李鹏;宋楠楠;赵元昊;孟红3.人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定 [J], 李小青;张国成;许东亮;李志宏4.人肠道病毒71型及柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的真核表达 [J], 徐晓园; 李文丽; 徐岚; 李蕊5.肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及在高通量抗体筛选中的应用 [J], 崔珂;孔亚茹;马传敏;张振杰;史卫峰;全传松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较
评价病毒分离培养、RT-PCR及实时荧光RT-PCR法对于肠道病毒71型的检测效果。
方法分别用病毒分离培养、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法对2009年龙岩市手足口病哨点监测医院送检的153份手足口病患者咽拭子样本进行EV71检测，并对检测结果进行配对卡方检验。
结果3种方法总体符合率为81.0%，3种检测方法对样本中EV71阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法均适用于EV71的检测，可以作为EV71的日常临床诊断方法。
手足口病是全球性传染病，研究表明，主要由肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）引起[1]。
2种病毒基因型相似并且表现类似的临床症状，其中EV71还能引起严重的神经系统疾病，甚至危及生命，因而具有更大的危害性[2，3]。
2008-04/05，通过病毒分离、RT-PCR、实时荧光RT-PCR 3种方法同时对2009年龙岩市手足口病监测哨点医院送检的153份手足口病患者咽拭样本进行EV71检测。
现将检测结果分析如下。
1 材料与方法
1.1 样本来源采集龙岩市手足口病监测哨点医院手足口病患者咽拭样本。
样本由专业人员采集，置于保冷箱送检。
所有样本置-70℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 样本处理咽拭子在样本保存液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，1000r/min离心20min，用上清接种细胞及提取病毒RNA。
1.2.2 病毒分离咽拭子样本经过滤除菌后直接接种人横纹肌癌细胞（RD），每份样本同时接种两管，待管内细胞长满单层时，每管接种0.2mL，置于37℃、5％的二氧化碳培养箱内培养，每日观察细胞病变（CPE），待CPE达到+++以上将培养管置于－20℃保存，即为阳性分离株；如果无CPE，则盲传2代，每代连续观察7d以上，判为阴性株。
1.2.3 病毒RNA的提取用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）试剂盒分别从咽拭上清和病毒分离培养物中提取，具体的方法见文献[4]。
1.2.4 RT-PCR反应用EV71特异性引物对样本进行一步法RT-PCR反应，引物序列由国家CDC提供，EV71-S上游：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`，EV71-A下游：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`。
PCR产物长度为226 bp。
反应体系所有耗材均购自TaKaRa公司，反应体系25 μl，其中Taq DNA聚合酶0.15 ul，M-MLV 0.25 ul，PCR Buffer 2.5 ul，dNTPs 2.0 ul，RNase Free dH2O 12.1 ul，上游引物与下游引物（10μmol/L）各0.5 μl，模板7 ul。
在Life Pro基因扩增仪上进行扩增。
反应程序：42℃45min 1个循环，然后95℃20s、45℃30s、72℃30s 进行35个循环后转入72℃•10min。
取8μl扩增产物在2%琼脂糖（含EB）上电泳，在100V电压电泳30min，用自动凝胶成像系统分析结果。
1.2.5 实时荧光定量RT-PCR 采用深圳太太基因工程有限公司EV71实时荧光RT-PCR试剂盒，按说明书进行反应体系的配制和循环参数的设置，同时设置阳性和阴性对照。
在实时荧光PCR检测仪（ABI 7300）上进行PCR检测。
结果判定严格按照仪器操作说明书和PCR 检测试剂盒说明书进行。
1.3 质量控制由两位实验员分别用病毒分离、RT-PCR、实时荧光RT-PCR三种方法同时进行EV71检测。
正式实验前，对实验人员进行统一培训，统一实验标准和步骤，确保实验结果真实可靠。
对结果有差异的样本，由两人共同进行一次复检，根据复检结果修正试验结果。
2 结果
2.1 3种方法检测结果比较共对153份咽拭样本同时进行3种方法的检测，病毒分离培养法有病变的共有28份，经RT-PCR鉴定EV71阳性22份，阳性检出率为14.4%；RT-PCR 法检出EV71阳性17份，阳性检出率为11.1%；实时荧光RT-PCR法检出EV71阳性26份，阳性检出率为17.0%。
其中3种方法均检出阳性的样本有8份，阳性符合率为5.2%，3种方法均检出阴性的样本有116份，阴性符合率为75.8%，总体符合率为81.0%。
2.2 3种方法检测结果两两比较用配对设计下两组频数分布的卡方检验对3种实验方法的结果进行比较，P值均大于0.05，均无显著性差异，说明3种方法检测出阳性样本的概率是一样的，即3种方法从咽拭样本中检出EV71的结果差异无统计意义，见表1、表2、表3。
3 讨论
手足口病主要由EV71和CAl6引起，一般感染学龄前儿童，是一种可预防、可治愈的疾病，治疗关键在于早发现、早诊断。
对于实验室检测方法选择应用，主要是考虑方法本身的敏感度与特异性以及适用性，3种方法在阳性检出率方面没有统计学差异，特异性和适用性方面却各有所长。
分离培养可获得特定的病毒，对于疾病的诊断来说有直接证据的作用，对于确定诊断意义重大，但由于实验操作步骤烦琐、检测周期长，无法满足疫情早期诊断的需要[5]，但该方法适用于进一步病原研究。
近几年来，PCR技术已广泛应用于病原微生物的检测与诊断，RT-PCR法也是卫生部《手足口病预防控制指南》（2008年版）推荐的检测方法，它相对于病毒分离培养法节省了很多时间，仪器设备和试剂的费用相对便宜，容易在各级疾控部门开展，可以满足疫情流行期大量样本的快速检测。
实时荧光RT-PCR采用单管闭合及特异性标记的探针来实时监控扩增产物，扩增后不打开管盖直接通过管内荧光强度进行定量，在检测时间和检测灵敏度上均有了明显的提高，被广泛地应用于各种病原的检测[6]，但由于仪器的购置费用较高，较难在基层单位中推广。
本研究通过三种方法的比较，实时荧光RT-PCR阳性检出率略高于其他两种方法，但差异尚无统计学意义，各实验室可根据自身的条件及开展检测的目的选择相应的检测方法。
手足口病已在世界范围内流行，导致严重的并发症甚至死亡。
目前对其流行特点已有了较深的认识，建立高效、快速、简便、特异的检测方法以适应各层次检测部门为今后的重点。
