植物内生真菌的分离

银杏内生真菌的分离纯化及抑菌性的鉴定作者：裴冬丽等来源：《湖北农业科学》2015年第09期摘要：采用组织分离法从银杏（Ginkgo biloba）健康组织中分离得到25株内生真菌，根据菌株在PDA培养基上的培养特征，5株被鉴定为链孢霉菌属、4株为酵母属、4株为曲霉属，3株为毛霉属、3株为青霉属，2株为根霉属，1株为简梗孢霉属，3株分离菌株不产孢子。

测定25株内生真菌对3种受试指示菌的抑制作用，共筛选得到11株至少对一种指示菌的生长有抑制作用的菌株，对抑菌活性较强的菌株进行形态学和显微分析鉴定。

关键词：分离；鉴定；银杏（Ginkgo biloba）；内生真菌；抑菌性中图分类号：S664.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2116-04自第一株内生真菌1898年从黑麦草种子中分离出来以后，植物内生真菌才被广泛地关注。

内生菌最早是指在植物组织内生长的微生物，用来区分那些在植物表面上生长的表生菌。

现内生真菌定义为在其生活史的一定阶段或全部阶段，在健康植物组织和器官内部中生长的，且不会使其被感染的宿主（至少是暂时）表现出外在病症的一类真菌。

内生真菌多样性丰富，生物活性强，生长在植物体内的内生真菌可以和相对应的宿主相互协同、共同进化，并且还可以生成与宿主相同或相似的具有生物活性的代谢产物[1]，它们不仅能促进宿主植物快速生长，而且还可有效地增强宿主对生物胁迫和非生物胁迫的抗逆能力。

已有研究表明，植物内生真菌可以分泌一些新的活性物质对不同细菌、病原真菌产生抑制作用[2-5]。

银杏树（Ginkgo biloba）又名白果树，是第四纪冰川运动后遗留下来的最古老的裸子植物，是世界上珍贵树种之一，被称作植物界中的“活化石”。

它生长较慢，寿命极长，自然条件下从栽种到结银杏果需要20多年，40年后才能大量结果。

大多数植物在其生长过程中会受到几种甚至几十种病原菌的侵袭，但银杏在这漫长的生长过程中却很少发生病害，这可能与银杏内部含有特殊的内生真菌有关。

植物黄芪根内生真菌的分离马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【摘要】An experiment was conducted to isolate endophytic fungi from healthy root of Astragalus membranaceus var. mongholi-cus under different conditions by means of surface disinfection and selection of culture medium. The morphological identification of the fungi was made. Result showed that the surface disinfection method was effective. Different numbers of endophytic fungal strains were obtained on four kinds of culture media. The morphological characteristics of the endophytic fungi observed through the microscope were analyzed. A total of 28 strains of endophytic fungi were isolated from the healthy root of A. membranaceus var. mongholicus, which belong to seven genera.%以蒙古黄芪健康植株上的块根为材料,经过表面消毒、培养基选择,在不同培养条件下分离获得内生真菌,并对其进行形态学鉴定.结果显示:表面消毒方法有效,4种培养基上分别获得不同数目的内生真菌株,显微镜下获得了内生真菌形态特征.分离获得黄芪内生真菌28株,分列在7个菌属中.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2012(040)004【总页数】3页(P62-63,116)【关键词】黄芪;内生真菌;形态鉴定【作者】马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【作者单位】黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】S567.2蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］为名贵中药材。

分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。

（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。

（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，等待其凝结后用作注射。

2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。

3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。

（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。

（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，洗过的扔掉。

（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。

4.表面杀菌：在无菌操作台中展开（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。

（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。

d植物内生菌分离处理方法刘明志。

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。

热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。

用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。

每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。

幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。

红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。

1刘金花。

黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。

２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。

待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。

2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。

取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。

内生菌分离和纯化。

将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。

植物内生真菌的分类鉴定方法植物内生真菌是指在植物体内生活并与植物形成共生状态的真菌。

它们在植物生长和发育中扮演着重要角色，可促进植物的生长和抵抗病原微生物的能力。

对植物内生真菌进行分类鉴定是研究植物与真菌相互作用的重要基础。

本文将介绍植物内生真菌的分类鉴定方法。

一、分类鉴定的样本采集和处理1. 样本采集：根据需要采集植物的根系样本，选择表现出明显病状或异常的植株，或者在不同生长时期采集不同部位的样本。

2. 样本处理：将采集的样本用刀片或消毒的剪刀从植物体上切取。

为了避免外源杂菌的污染，可以在取样前用70%酒精或漂白粉消毒，然后用无菌蒸馏水或含有保鲜剂的缓冲液清洗数次，将清洗后的样本装入无菌离心管中。

二、分类鉴定的培养方法1. 消毒：将采集的样本在无菌工作台上消毒，可以用70%酒精或漂白粉进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水洗涤数次。

2. 培养基：选择适当的培养基进行分离培养。

一般常用的培养基有马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）、玉米粉蔗糖琼脂培养基（CMD）、毛状植物根培养基等。

3. 分离培养：将处理好的样本放置在培养基上，均匀涂抹或切割后排列，然后放置在适当的温度和湿度条件下培养。

4. 培养温度和时间：一般情况下，在适宜的温度（25-28°C）和光照条件（12小时光照/12小时暗）下培养一周左右，观察是否有菌落形成。

5. 菌落转接：当菌落形成后，可以用无菌环取样，将菌落转移到新的培养基上进行纯培养。

6. 保存：可以将纯培养的菌株进行保存，可以冷冻保存或进行液氮冻存。

三、分类鉴定的鉴定方法1. 形态学鉴定：通过观察菌落的形态、色素、菌丝等形态特征，以及产孢体、分生孢子的形态特征等来进行鉴定。

可以借助显微镜观察菌丝的形态、菌落的形态、菌丝状产孢体和产生的孢子形态。

2. 分子生物学鉴定：采用PCR方法对菌株进行鉴定。

通常可以从菌落或孢子中提取菌株的DNA，然后进行PCR扩增，再通过序列分析进行鉴定。

红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【摘要】本文对厦门集美红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的多个部位进行内生真菌的分离和形态鉴定,并采用菌饼法对分离到的内生真菌进行抗菌活性筛选.结果显示,从3种红树植物的根、茎、叶中分离得到25株内生真菌,分别隶属8个类群,以链格孢属和曲霉属为主,分别占菌株总数的28.0％和24.0％;有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用,占菌株总数的76.0％.研究结果表明,红树植物来源的内生真菌数量多,种属丰富,同时具有良好的抗菌活性,是研究抗菌活性化合物的重要资源.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)003【总页数】4页(P263-266)【关键词】红树植物;内生真菌;分离鉴定;抗菌活性【作者】陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q939内生真菌(endophyte)是指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。

不但对促进宿主植物的生长发育，增强抗逆性起到重要作用，而且许多内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质［1-2］。

目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3-6］。

植物内生真菌的分类鉴定方法
植物内生真菌是指生活在植物体内或附近，与植物形成共生关系的一类真菌。

这些真菌可以帮助植物吸收养分、增强植物的抗病性等，对植物生长具有重要作用。

对于植物内生真菌的分类鉴定，可以采用以下几种方法：
1. 形态学鉴定法
形态学鉴定法是一种基于真菌形态特征的分类方法，主要包括菌落形态、菌丝特征、孢子形态、色素产生等方面的观察和比较。

通过对真菌的形态特征进行鉴定，可以初步确定其属种，但是这种方法需要专业的技术支持和丰富的经验，并且受到环境因素、培养条件等因素的影响。

2. 分子生物学鉴定法
随着分子生物学技术的不断发展，分子生物学鉴定方法也得到了广泛应用。

这种方法主要基于真菌的DNA序列比对和系统进化关系的分析，可以提供较为准确的分类信息。

其中，PCR扩增技术和DNA序列比对技术是常用的分子生物学鉴定方法，它们可以直接从真菌的DNA样本中扩增特定的基因片段，对其进行测序和比对，确定其系统进化关系和分类归属。

生态学鉴定法主要基于真菌所处的生态环境和宿主植物的物种信息，通过对真菌的生境和宿主植物类型的分析来确定其分类归属。

这种方法适用于野外采集样品或样品信息不全的情况，在实际应用中其准确性会受到一定局限。

4. 蛋白质分析鉴定法
蛋白质分析鉴定法是一种基于真菌蛋白质表达模式的分类方法，主要通过电泳技术对真菌种群中的蛋白质进行分离和鉴定，根据不同的蛋白质组成来确定其分类归属。

这种方法适用于对真菌菌株进行基础研究和比较分析。

总之，对于植物内生真菌的分类鉴定，需要综合运用多种方法进行确认和检验，结合形态学、分子生物学、生态学和蛋白质分析等多种技术手段，才能提高分类准确性和可靠性。

中国红树植物角果木内生真菌的分离及其初步鉴定古海刚;白红进;曾艳波;常东东;梅文莉【摘要】Ninety-five endophytic fungal strains were isolated from the healthy roots, branches and leaves of mangrove plant Ceriops lagal. Ninety-Four of them were classified into Fungi Imperfecti based on their morphological and microscopic features, twenty-eight sporulated strains were identified to thirteen genera. The rest sixty-six non-sporiferous strains were tentatively classified into Mycelia Sterilia. Still one belonged to Basidiomycetes. The result indicated the endophytic fungi of mangrove plant Ceriops tagal showed certain tissue specificity to the host. There were comparatively large differences in quantity, population and composition of fungi isolated from leaves as compared with those from roots and branches. This research enriched the fungal resources, and provided basic theoretical foundation to develop and utilize the endophytic fungi resources in officinal of the genus of Ceriops.%从中国红树植物角果木(Ceriops tagal)健康的树根、枝、叶中分离得到95株内生真菌.依据其菌落形态和显微特征,将其中94株归为半知菌类,即产孢的28株鉴定为13个属,剩下未产孢的66株暂归为无孢菌群,还有1株属于担子菌纲.结果表明,中国红树植物角果木内生真菌对宿主具有一定的组织专一性,树叶的真菌在数量、种群及其组成方面与根、枝相比存在较大差异.丰富了真菌资源,为角果木属药用植物内生真菌资源的开发利用提供了基础理论依据.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2012(032)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】红树植物;角果木;内生真菌;分离;鉴定【作者】古海刚;白红进;曾艳波;常东东;梅文莉【作者单位】塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔843300;塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔843300;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】Q93-331中国红树植物角果木(Ceriops tagal)是红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceriops)的常绿植物，别名剪子树、海枷仔、海淀子(海南)［1］。