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免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。
单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
