嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

一种嗜热芽孢杆菌所产耐高温纤维素酶的特性
王鹏;贺芸;杨军方;李大力
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2012(040)009
【摘要】筛选得到了产耐高温纤维素酶的嗜热芽孢杆菌,发酵获得了耐热纤维素酶,试验结果显示该酶最适温度为70℃,最适pH值为7.0,Km值为5.0×10-3
g/mL,Fe3+对酶有强烈毒害作用,十二烷基苯磺酸钠对酶活性有促进作用.酶促降解纤维素主要产物为葡萄糖.
【总页数】3页(P348-350)
【作者】王鹏;贺芸;杨军方;李大力
【作者单位】南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
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及其活性分析 [J], 胡芮;孙晓晖;杨淼森;唐旭;徐长安;贾若琨
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嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理以嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理为标题，本文将探讨嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理及其应用。

嗜热脂肪芽孢杆菌是一种厌氧芽孢杆菌，广泛存在于土壤、水体和动植物体内。

该菌对高温环境适应能力强，能够在70°C至80°C的温度下存活生长。

由于其在高温环境下的生长特性，嗜热脂肪芽孢杆菌常被用作指示剂，用于检测高温灭菌过程中的杀菌效果。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理是基于该菌在高温下的存活特性。

在制备指示剂时，嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子会被固定在载体上，如滤纸或玻璃片。

制备完成的指示剂会呈现为白色或黄色，这是由于固定的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的存在。

在高温灭菌过程中，如果灭菌条件不足或操作不当，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子会存活下来。

为了检测灭菌的效果，可以将嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂放置在被灭菌物品的不同位置，如内部和外部。

经过灭菌过程后，若指示剂上的孢子仍然存活并呈现白色或黄色，则说明灭菌过程存在问题，杀菌效果不理想。

相反，如果指示剂上的孢子变为黑色，则表明灭菌过程有效，杀菌效果良好。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的应用范围广泛。

它常被用于医疗机构、实验室、食品加工厂等场所进行高温灭菌过程的监测。

通过使用指示剂，可以及时发现灭菌设备是否正常运行以及灭菌效果是否达标，帮助保障工作环境的安全和产品的质量。

除了在高温灭菌过程中的应用，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂还可用于研究嗜热脂肪芽孢杆菌的生态学特性和抗菌机制。

通过对指示剂上存活的孢子进行分离和培养，可以进一步研究嗜热脂肪芽孢杆菌的生长条件和生理代谢特点。

此外，还可以利用嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂进行抗菌药物的敏感性测试，评估不同抗菌药物对嗜热脂肪芽孢杆菌的抑菌效果。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂是一种基于嗜热脂肪芽孢杆菌在高温环境下存活特性的指示剂。

它广泛应用于高温灭菌过程的监测，可以及时发现灭菌问题并保障工作环境的安全和产品的质量。

嗜热芽孢杆菌XJT—9503高温中性蛋白酶的研究Ⅱ.酶的
提纯及酶学特性研究
活泼;潘惠霞;王志方;冯蕾;石玉瑚
【期刊名称】《生物技术》
【年(卷),期】1997(7)3
【摘要】嗜热芽孢杆菌XJT—9503菌的发酵液经硫酸铵和丙酮分级沉淀分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的高温中性蛋白酶制品。

SDS—PAGE测得酶分子量为3000。

当以酪蛋白为底物时，酶反应最适温度为65℃，最适pH为7．在
PH6．5—9范围内稳定。

在65℃、0、02MpH7．5的磷酸缓冲液中的半衰期为54min。

金属离子铜、汞、铝强烈抑制酶活，钙离子，镁离子对酶活有促进作用。

【总页数】4页(P18-21)
【关键词】嗜热芽孢杆菌;高温中性;蛋白酶;提纯;酶学性质
【作者】活泼;潘惠霞;王志方;冯蕾;石玉瑚
【作者单位】新疆农业科学院微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.124
【相关文献】
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芽孢杆菌耐高温的原因
芽孢杆菌一般是指嗜热脂肪芽孢杆菌。

通常情况下，嗜热脂肪芽孢杆菌耐高温，并且耐热性比较强。

具体情况分析如下：嗜热脂肪芽孢杆菌为嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，耐热性是非常强的，在经过高温之后，也可能会残留一部分，是造成食品腐坏和变质的主要微生物之一，在食品保存方法不正确或者是存放的时间比较长时，可能会导致里面滋生很多嗜热脂肪芽孢杆菌，而且经过高温的烹饪之后，也不能达到完全杀灭的效果，可能会导致人体出现急性胃肠炎、食物中毒等不良反应，表现为呕吐、腹泻、腹痛等。

建议滋生了嗜热脂肪芽孢杆菌的食物即使加热也不要再吃，不利于身体健康。

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆
杨庆云;江行娟
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1991(007)003
【摘要】用鸟枪法把嗜热脂肪芽孢杆菌313-1(供体菌)染色体上的蛋白酶基因克隆到质粒pPL603上,并在枯草杆菌中得到表达。

此基因位于6.6kb的EcoRI酶切片段上,带有重组质粒的枯草杆菌所产生的蛋白酶活性比供体菌株约提高30倍左右。

该酶的最适反应温度为75℃,最适pH为7.0左右,是一个中性蛋白酶,在80℃作用30min后仍保留85%以上的酶活。

【总页数】6页(P207-212)
【作者】杨庆云;江行娟
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
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嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），是一种广泛存在于自然环境中的细菌，其特点是喜好生长于高温环境，并且具有较高的耐热性。

淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌产生的一种酶类物质，具有重要的应用价值。

淀粉酶是一类在淀粉颗粒水解过程中起关键作用的酶类。

它能够催化淀粉分子内部的α-1,4-葡萄糖键断裂，从而将淀粉分解为较低聚的糊精、麦芽糊精和麦芽糖等产物。

由于淀粉是一种常见的多糖类物质，在食品工业、饲料工业和生物技术等领域具有广泛的应用前景。

嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶具有多种优点，使其在工业上得到了广泛的应用。

首先，嗜热脂肪芽孢杆菌的生长温度适应范围较宽，能够在较高的温度下生长，从而提高了淀粉酶的生产效率。

其次，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶在高温下仍保持较高的活性，能够在高温条件下进行淀粉的水解反应，提高了工业生产的温度范围。

此外，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶对底物的亲和力较高，能够高效地水解淀粉颗粒，提高酶的利用率。

淀粉酶的应用领域非常广泛。

在食品工业中，淀粉酶可以用于面包、饼干、饼子等面点制品的生产中，通过调控面团中淀粉的水解程度，改善产品的质地和口感。

在饲料工业中，淀粉酶可以用于动物饲料的加工中，通过降低饲料中的淀粉含量，提高饲料的消化率和营养价值。

在生物技术领域，淀粉酶可以用于生物燃料的生产中，通过将淀粉转化为可发酵的糖类物质，为生物燃料的产生提供原料。

除了在工业应用中，淀粉酶还具有一定的医学价值。

研究发现，淀粉酶对人体消化系统中的淀粉消化起到重要的作用。

通过补充淀粉酶，可以改善人体对淀粉的消化吸收，从而缓解消化不良等相关问题。

总结来说，嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶是一种具有重要应用价值的酶类物质。

它在工业生产中具有广泛的应用前景，在食品工业、饲料工业和生物技术领域发挥着重要作用。

同时，淀粉酶在医学领域也具有一定的价值。

未来的研究和应用将进一步拓展淀粉酶的应用领域，为人类的生产和生活带来更多的便利和效益。

3武汉市晨光计划资助项目(985003077)1现在工作地址:四川涪陵师范学院生物系;2通讯作者作者简介:唐　兵(1968-),男,山东省济南市人,武汉大学生命科学学院副教授,博士,主要从事微生物生理及应用微生物学研究收稿日期:1998205208,修回日期:1998210219嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质3唐　兵　周林峰　陈向东　戴　玄1　彭珍荣2(武汉大学生命科学学院　武汉　430072)摘　要:对嗜热脂肪芽孢杆菌(B acillus stearothermophilis )WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在p H 值为715的Fd 培养基中振荡发酵培养48h 后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL 以上。

对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD ,最适作用p H 为810,最适作用温度为80℃,具有良好的p H 稳定性及热稳定性。

Ca 2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF 、DFP 及IAA 能强烈抑制酶活力,而DTT 对该蛋白酶活力无影响。

关键词:嗜热脂肪芽孢杆菌WF146,高温蛋白酶,性质中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2000)02-0188-92蛋白酶是一类广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面的重要工业用酶。

而高温蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点,有重要应用价值。

不仅如此,对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶,从而提高其稳定性提供理论依据。

人们已经从许多嗜热细菌中分离到高温蛋白酶[1～3],其中嗜热解朊芽孢杆菌(B acill us thermoproteolyticus )生产的嗜热蛋白酶(thermolysin )已在工业上用来生产二肽甜味剂(aspartame )[4]。

但是,高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。

我们筛选到一株高温蛋白酶的高产菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophil us )WF146[5],对其产酶条件及一些酶性质进行了研究。

中国科学C辑:生命科学 2008年 第38卷 第2期: 166~172 166 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究张敏①②, 赵丛①, 杜连祥①, 路福平①*, 高晨③①天津科技大学生物工程学院, 天津 300457;②沈阳农业大学工程学院, 沈阳 110161;③南开大学生命科学学院, 天津 300071* 联系人, E-mail: lfp@收稿日期: 2007-07-08; 接受日期: 2007-10-13国家高技术研究发展计划(批准号: 2007AA02Z212)资助项目摘要本文中嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)的高温中性蛋白酶基因在sacB基因启动子的调控下, 以蛋白酶自身或sacB基因的序列为信号肽, 分别实现了在枯草芽孢杆菌DB104中的高效表达. 表达产物经纯化后, 酶的比活力可达16530 U/mg, 纯化倍数达到3.8倍, 分子量约为35 kD. 对酶学性质的研究结果表明, 此酶的最适反应温度为65,℃最适作用pH为7.5, 在65℃下反应1 h后, 仍可保留约80%的活力. 关键词枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 高温中性蛋白酶表达纯化酶学性质工业用酶约占世界酶总量的60%, 而蛋白酶是工业用酶中最重要的组成部分[1], 它能够催化蛋白质水解. 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以分泌大量的胞外酶, 这些酶被广泛地应用于洗涤剂、食品、制药、皮革和化工等行业[2,3].许多种嗜热菌可以产生热稳定性高的胞外蛋白酶, 例如Bacillus stearothermophilus[4], Thermos aqua-ticus[5], Bacillus licheniformis[6], Bacillus pumilus[7]和Thermoanaerobacter yonseiensis[8]等, 其中有些种类在工业生产中具有非常重要的作用. 由于它们具有高的反应温度和良好的热稳定性, 因此能够加快催化反应速率, 提高非气态底物和产物的溶解性, 从而降低染菌的几率. 在嗜热蛋白酶中, 高温中性蛋白酶得到了广泛地研究[9∼11]. 例如, Fujii等人[12]报道了嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)高温中性蛋白酶基因的克隆与表达, 实验表明蛋白酶的作用pH呈中性, 于65℃下反应30 min后仍可保留约80%的活力. 同时, Huang等人[13]也报道了对嗜热枯草杆菌HS08高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质的研究, 所得蛋白酶在40~65℃间均具有较好的热稳定性, 于65℃下反应1 h后仍可保留75%的酶活力.本研究室从土壤中得到了一株高产高温中性蛋白酶的B. stearothermophilus, 将该菌于46℃下培养60 h并纯化后, 蛋白酶的比活力可达11240 U/mg, 蛋白酶表达产物的分子量约为35 kD, 最适作用温度和pH分别为65℃和7.5, 将该酶于65℃下反应1 h后仍可保留80%的酶活力. 但是, 由于 B. stearothermo-philus的培养温度较高, 限制了其大规模的生产, 因此有必要来构建一个能够在中温下进行表达的系统. 同时, 枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理想的异中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第2期167源蛋白表达系统[14], 其优点在于可以高效地表达具有生物学活性的异源蛋白并将其分泌至培养基中[15], 而且枯草芽孢杆菌也具有较高的生物安全性.因此, 本文将高温中性蛋白酶基因克隆入B. sub-tilis , 来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行诱导表达的系统, 使该基因处于sacB 基因启动子的调控下, 并分别以自身或sacB 基因的序列作为信号肽. 同时, 对高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质也进行了研究.1 材料与方法1.1 菌种、质粒和培养条件B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 作为蛋白酶的表达宿主[16]; 大肠杆菌(E. coli ) JM109是基因操作的克隆宿主[17], 2个菌株均于37℃下LB 培养基中进行培养. 重组大肠杆菌用LB 培养基(含30 µg/mL 氯霉素(Cm))进行培养和筛选, 而重组枯草芽孢杆菌用LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em))进行培养和筛选.pBSAT 质粒上含有sacB 基因, 由本研究室构建. 质粒pHP13PS 是由pHP13载体(E. coli -B. subtilis 穿梭载体)构建而来的, 其上含有sacB 基因的启动子和信号肽序列; 质粒pHP13P 也是由pHP13载体构建而来的, 但其仅含有sacB 基因的启动子序列.1.2 DNA 的操作本实验所采用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购自TaKaRa 公司; DNA 片段的分离纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA 连接以及对大肠杆菌的转化等操作均参照分子克隆实验指南[17].1.3 高温中性蛋白酶序列的克隆根据已发表的高温中性蛋白酶基因的全序列, 设计用于扩增高温中性蛋白酶基因(nprT )的一对引物, 此基因包括信号肽、前肽和成熟肽序列. 两个引物序列分别为5′-CCGGTCGACGGGAAAATTGGAAAA- TGAAAAGG-3′(Sal Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAG- TGGAGGAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). PCR 反应条件: 94℃, 5 min; 94℃, 1 min, 55℃, 1 min, 72℃, 2 min, 35个循环; 72℃, 10 min.根据nprT 基因序列, 设计用于扩增nprT"的2个引物, nprT"基因不包含信号肽序列. 2个引物序列分别为: 5′-CCCCCGGGGCCCAAGTATTTTTACCTTAC- AAT-3′(Sma Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAGTGGAG- GAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). 扩增的产物利用琼脂糖凝胶进行分离纯化, 并通过DNA 测序进行验证.1.4 诱导型表达载体的构建将用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1725 bp 的nprT 基因片段, 克隆入同样用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13P 载体上, 得到质粒pHP13PN, 该质粒上nprT 基因处于sacB 基因的启动子和自身信号肽序列的调控下(图1(a)); 将用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1651 bp 的nprT"基因片段, 克隆入同样用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13PS 载体上, 得到质粒pHP13PSN, 该质粒上npr T"基因处于sacB 基因的启动子和信号肽序列的调控下(图1(b)).1.5 高温中性蛋白酶基因的诱导表达将质粒pHP13PN 和pHP13PSN 按照Chang 等 人[18]的方法转化入B. subtilis DB104中, 分别得到重组子DB104/pHP13PN 和DB104/pHP13PSN. 再将重组子接入LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em)中, 于37℃, 200 r/min 的条件下培养2 h 后, 加入2%的蔗糖溶液诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 以未加蔗糖溶液的作为对照; 继续培养50 h, 将培养液于4℃, 14000× g 离心15 min 后收集上清以测定其酶活力. 同时, 用SDS- PAGE 法来检测高温中性蛋白酶基因的表达情况.1.6 高温中性蛋白酶(NprT)的纯化将培养物上清液用饱和度为80%的硫酸铵溶液进行沉淀后, 再加入20 mL 的Tris-HCl 缓冲液 (50 mmol/L, pH 7.5)溶解沉淀, 并于4℃下用同样的缓冲液透析12 h, 透析得到的溶液经DEAE-Sephadex A25柱层析后收集含有NprT 的部分, 再次用80%饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀后, 以0.3 mL/min 的速率用DEAE-Sephadex A50柱进行洗脱.1.7 蛋白酶NprT 酶活力的测定蛋白酶活力的测定是将1 mL 1%的酪素溶液(pH 7.5)与1 mL 的酶稀释液混匀, 于65℃下反应10 min张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究168图1 质粒的构建图谱(a) 质粒pHP13PN包含由sacB基因启动子和自身信号肽序列调控的nprT基因; (b) 质粒pHP13PSN包含由sacB基因启动子和信号肽序列调控的nprT"基因. Cm和Em分别为E. coli和B. subtilis中的筛选标记后, 加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA), 充分振荡后于14000×g下离心20 min, 取1 mL上清液采用Folin酚法测定酪氨酸的含量[19]. 蛋白酶活力单位定义为: l mL液体酶在65℃和pH 7.5的条件下, l min水解酪素产生l µg酪氨酸为1个酶活力单位.1.8温度和pH对NprT酶活力的影响将溶于Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L, pH 7.5) 的NprT分别于40~75℃下进行反应, 以测定纯化后NprT的最适反应温度. 纯化NprT的最适作用pH于65℃下分别在不同的缓冲体系中进行测定, 3种缓冲液分别为50 mmol/L乙酸钠溶液(pH 4.0~5.5)、50 mmol/L磷酸钠溶液(pH 6.0~7.0)和50 mmol/L Tris- HCl溶液(pH 7.5~9.0). 为测定NprT的热稳定性, 将溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的纯酶于65℃下作用不同的时间后, 测定其剩余的酶活力.2结果与分析2.1质粒pHP13PSN和pHP13PN的构建通过PCR扩增分别得到nprT和nprT"基因, nprT 基因包括信号肽序列(1~57 bp)、前肽序列(58~708 bp)和成熟肽序列(709~1656 bp)(图2)[20]. 为研究高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达, 构建了2个不同的表达载体. 其中, 质粒pHP13PN包含sacB 基因的启动子和nprT基因的信号肽序列(图1(a)), 而质粒pHP13PSN包含nprT"基因以及位于其上游的sacB基因的启动子和信号肽序列(图1(b)). 利用含Em的LB平板来筛选重组子, 每次筛选大约有20~30个转化子, 然后通过酶切和PCR扩增来验证插入基因片段的正确性.为确认质粒pHP13PSN和pHP13PN中sacB基因序列与高温中性蛋白酶基因序列之间的可读框连接正确, 我们分别测定了整个基因序列. 结果表明, 两个连接处的读码框均正确, 并且本实验克隆的高温中性蛋白酶基因序列与已报道的基因序列有99%的同源性(GenBank登录号: M21663).2.2高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达将构建的重组质粒pHP13PSN和pHP13PN分别转化B. subtilis DB104后, 向培养液中分别加入蔗糖溶液来诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 利用12% SDS-PAGE来进行检测. 电泳结果表明, NprT存在于培养物上清液中, 同时也表明NprT被成功地分泌到胞外(图3).在培养过程中, 定时取样测定上清液中NprT的酶活力(图4). 结果显示, 重组子pHP13PN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力达7020 U/mL, 而重组子pHP13PSN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力高达13580 U/mL, 表明sacB基因的信号肽序列对于nprT基因的表达效果更显著. 对含有NprT的粗酶液进行纯化(表1), 当纯化倍数为3.8时, 其比活力可达中国科学C辑: 生命科学 2008年第38卷第2期图2 nprT基因的核苷酸和氨基酸序列169张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究170图3 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: pHP13/DB104培养物的上清液(对照组); 2: pHP13PN/DB104培养物的上清液; 3: pHP13PSN/DB104培养物的上清液图4 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达情况的比较■: 质粒pHP13PN上含有nprT基因和自身的信号肽序列; ▲: 质粒pHP13PSN上含有nprT"基因和sacB基因的信号肽序列; ×: 质粒pHP13上未插入外源基因16530 U/mg, 提高了13.4%, 而Huang等人[13]的研究表明NprT的比活力仅为13172 U/mg, 提高 5.1%. SDS-PAGE分析的结果表明(图5), 有一分子量约为35 kD的特征蛋白带出现, 大小与出发菌株的一致.图5 NprT纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: 纯化NprT2.3温度和pH对NprT酶活力的影响将纯化的NprT分别于40~75℃温度下反应, 测定NprT酶活力. 结果表明(图6(a)), 酶的最适反应温度为65℃, 当反应温度超过65℃以后, 酶活力迅速下降; NprT的作用温度范围较宽, 为55~75℃, 并且在40~ 65℃之间, NprT具有较好的热稳定性; 在65℃下反应1 h后仍可保留约80%的酶活力, 因此, NprT可被定义为嗜热酶. 研究不同pH对NprT酶活力的影响, 结果表明(图6(b)), 当pH<5.5时, 酶活力较低, 当pH>5.5时, 酶活力迅速升高; NprT作用的最适pH为7.5, 在pH 6.5~9.0范围内均有较高的酶活力.3讨论由于 B. subtilis向胞外分泌高浓度的蛋白酶[21],中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第2期171表1 NprT 的纯化结果步骤 体积/mL 总蛋白/mg 总酶活力/×104U 比活力/U·mg -1回收率/% 纯化倍数 粗酶液 500 525.5 228.6 4350 100 1 (NH 4)2SO 4盐析 300 387.2 195.1 5040 85.3 1.15 DEAE-Sepharose A25 167 74.4 92.6 12450 40.5 2.86 DEAE-Sepharose A5093 18.5 30.6 16530 13.4 3.8图6 温度(a)和pH(b)对高温中性蛋白酶活力的影响以致影响了表达产物的稳定性, 而B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 有助于提高分泌蛋白的稳定性. 同时在枯草杆菌表达系统中使用诱导启动子系统, 可以使外源基因在加入诱导剂之前并不表达, 从而不会影响到宿主菌的生长; 当加入诱导剂后, 就可以使外源基因得到表达, 从而保证了外源蛋白的稳定性和高产量. 蔗糖诱导系统是B. subtilis 两大天然诱导系统之一, 由sacA 和sacB 两个基因组成. 其中, sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶, 是一种受蔗糖诱导的胞外酶, 既具有蔗糖诱导表达所需要的诱导区域, 也具有使蛋白有效分泌的信号肽序列.对于中温菌 B. subtilis 的培养比高温菌 B. stearothermophilus 要容易得多, 将B. subtilis 作为高温中性蛋白酶基因的表达宿主会对酶的应用提供一个很有前景的方式. 本文中高温中性蛋白酶基因在 B. subtilis DB104中成功地实现了表达, 酶的比活力较出发菌株有所提高, 可达16530 U/mg. 实验结果表 明, sacB 基因的信号肽序列在引导高温中性蛋白酶进行分泌时所起的作用要优于蛋白酶自身的信号肽序列. 纯化酶的最适作用pH 和反应温度分别为7.5和65, ℃在65℃下反应1 h 后, 仍可保留约80%的活力. 实验结果也表明, 重组酶的性质与出发菌株的相同, 有必要对高温中性蛋白酶的动力学性质进行分析, 以确定蛋白酶的种类.本文首次利用sacB 诱导基因来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行高效诱导表达的系统, sacB 基因的表达不仅可以利用蔗糖来诱导, 其表达水平也可以通过一些多效调控基因来得到提高, 例如degQ , degU 和degS 基因[22∼24]. 目前, 本研究室正在构建含有多效调控基因的重组质粒, 这样将会使高温中性蛋白酶基因的诱导表达水平有更大的提高.张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究参考文献1 Nascimento W C A, Martins M L L. 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