下载文档原格式
实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定一、实验目的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜温，极易分离与培养。
由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治且备受关注。
本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生理生化特征进行纯化和鉴定及16S rDNA基因序列进行分析。
二、实验原理枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
枯草芽孢杆菌的分离方法：（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的益生菌，具有广泛的应用前景。
为了进一步研究枯草芽孢杆菌的特性和应用价值，需要进行有效的分离和鉴定方法的研究。
本文将介绍一种常用的枯草芽孢杆菌分离与鉴定方法，以供参考。
一、枯草芽孢杆菌的分离方法1. 采集样品：选择环境中富含枯草芽孢杆菌的样品，如土壤、植物根际土壤等。
使用无菌采样器具采集样品，并尽量避免外界污染。
2. 处理样品：将采集得到的样品（如土壤）样品称重，加入适量的无菌生理盐水中，进行悬浮液的制备。
通过振荡或搅拌等方式使样品充分悬浮。
3. 稀释样品：将制备好的样品悬浮液进行适度的稀释，以获得合适的菌落形成数量。
常用的方法是制备10^-1至10^-6的稀释液，通过分别取不同稀释液进行接种。
4. 铺平培养：将适量的稀释液取出，均匀地涂布在菌落计数板上或含有适宜培养基的琼脂培养基平板上。
用冷热板或菌液器辅助涂布，注意避免产生气泡。
5. 培养条件：将铺平的培养板放入恒温培养箱，温度设定为适宜的生长温度，一般为30-37摄氏度，培养时间一般为24-48小时。
6. 菌落取样：在菌落形成后，使用无菌物质（如铂丝、无菌酒精灯火焰炙烧的铁丝等）挑选出单个菌落，并将其转移到新的琼脂平板上。
重复此操作，直到获得纯种的枯草芽孢杆菌。
二、枯草芽孢杆菌的鉴定方法1. 形态学观察：采用显微镜观察培养得到的枯草芽孢杆菌菌落和孢子的形态特征。
枯草芽孢杆菌形成的菌落通常为凹陷型或突起型，孢子则呈椭圆形，具有芽胞的特征。
2. 细胞染色：将培养得到的枯草芽孢杆菌菌落取出，进行细胞染色。
常用的方法是使用革兰氏染色和孢子染色。
革兰氏染色可用于观察细菌细胞的染色性质和形态特征，孢子染色则可用于观察细菌芽胞的形态特征。
3. 生理生化特征检测：通过生理和生化实验，检测枯草芽孢杆菌的一些代谢特征。
包括对碳源的利用情况、产酶的能力、乳酸发酵能力等。
常用方法包括碳源利用试验、酶活性测试、氧化还原试验等。
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。
枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。
针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。
二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。
将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。
2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。
通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。
3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。
利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。
4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。
5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。
1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。
常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。
2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。
3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。
通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。
蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工**班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2配制200mL奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2脱脂奶粉 3g，配制200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
（三）筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定一、目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。
将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。
，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、材料和器皿：显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇四、操作步骤菌种的分离和纯化（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。
（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。
（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。
吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。
（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2天备用。
菌种的鉴定1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌种的形态（2）菌种形态的观察2.革兰氏染色3.芽孢染色4.菌体大小测验5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定一、淀粉水解一、原理许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
产胶原酶地衣芽孢杆菌菌种的分离、筛选及发酵条件研究金敏;王忠彦;胡承;袁铸;胡永松
【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2000(037)005
【摘要】从成都皮革厂等处采集的样品中,分离筛选到一株胶原酶的产生菌J-4-8,菌种鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis).该菌产酶的最适碳源为蔗糖,氮源为明胶,起始pH为7.5,容瓶装量为10mL,种龄是24h,接种量为6%.在此条件下,摇瓶振荡发酵后,酶活达25U/mL发酵液,较原发酵培养基发酵后的酶活提高35%.【总页数】4页(P764-767)
【作者】金敏;王忠彦;胡承;袁铸;胡永松
【作者单位】四川大学生命科学学院,成都,610064;四川大学生命科学学院,成都,610064;四川大学生命科学学院,成都,610064;四川大学生命科学学院,成
都,610064;四川大学生命科学学院,成都,610064
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-331
【相关文献】
1.芽孢杆菌074碱性纤维素酶的研究：Ⅰ.菌种的分离,筛选及发酵条件 [J], 宋桂经;王冬
2.产β—甘露聚糖酶地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件 [J], 杨文博;沈庆
3.地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究：I.碱性蛋白酶高产菌的筛选及产酶条件初探[J], 胡承;彭勇
4.产果胶酶芽孢杆菌Xg—01的分离,筛选及发酵条件的研究 [J], 郭爱莲;王少辉
5.嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅰ.菌种分离、筛选及发酵条件的研究 [J], 邱秀宝;程秀兰;袁影
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产青霉素酶杆菌的分离、优化及酶活力的检测一、实验目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离产青霉素酶的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
4、学习并掌握细菌培养基的制备。
5、学习并掌握细菌发酵液产酶活性的检测方法。
二、实验原理青霉素酶(EC3. 5. 2. 6) 是催化水解青霉素β-内酰胺环, 使青霉素变成无抗菌活性的青霉素酮酸的一类β-内酰胺酶。
早在1940 年青霉素还未广泛应用于临床时,Abraham 等就从耐青霉素的 E.coliK12 中发现了青霉素酶, 该酶也是关于Β-内酰胺酶的首次报道。
随后在地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌中相继发现了这种特性的青霉素酶。
并对地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的发酵条件、酶学性质和基因序列进行了研究。
虽然细菌产生青霉素酶是导致出现耐药性的原因之一, 但利用青霉素酶具有水解β-内酰胺类抗生素的特点, 可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。
该酶最具广阔应用前景的用途是用于对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进行处理。
国外在20 世纪80 年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究, 近年对青霉素酶生物传感器的研究非常活跃。
另外, 由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点, 其可在酶联免疫吸附试验(ELISA ) 中替代传统的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
我国在青霉素酶的研究方面起步较晚。
1999 年,中国药品生物制品检定所在我国最先分离出一株能产生青霉素酶的蜡状芽孢杆菌CM CC (B ) 63301, 并对该酶的发酵方法、水解酶谱和保存稳定性等方面进行了研究。
该菌株作为青霉素酶产生菌已被收入中国药典。
但目前国内在青霉素酶的研究和应用方面的报道较少。
枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm，营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。
无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。
斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。
在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。
当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。
在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。
在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。
有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为45~55℃，最适为37℃。
枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶冻化牛乳还原硝酸盐不产生吲哚，硫化氢 V-P反应阳性，水解淀粉。
葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。
地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。
革兰氏液染色呈紫色阳性菌。
细胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。
菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。
1.样品：外购菌种商品微生物制剂（固体或液体）土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置 PH 植被情况等）。
2.菌种分离与纯化2.1．培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L 蛋白胨10g/L 酵母膏3g/L KH2PO41.5g/L K2HPO42g/LMgSO40.1g/L PH 7.4—7.6 （富集用）2.1.2肉汤（NA）培养基（营养琼脂）：蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl5g/L PH7.2—7.4（保存计数或分离纯化用）营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖3.5g/L NaCl5g/L K2HPO40.5g/LMgSO43g/L MnSO4 25mg/L PH 7.2—7.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L 蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl 5g/L PH7.2—7.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L，酵母膏1g/L，酪素4-5g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
