第8章双水相萃取技术

高等分离工程课程论文双水相萃取技术的发展与应用随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。

但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求及其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术-双水相萃取技术应运而生，双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。

由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。

目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，被认为是生物工程中一种具有广阔应用前景的分离技术，在电化学生物传感器中生物活性分子的制备中至关重要。

1 双水相萃取的基本要点1.1 双水相萃取的原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。

对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。

将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。

双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。

一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。

1.2 双水相的种类双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。

最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等)体系,其次是聚合物/低分子量组分、离子液体体系和高分子电解质/高分子表面活性剂体系。

蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。

双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。

1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。

早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。

双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。

双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。

当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。

双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。

美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。

2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。

第8章 双水相萃取技术第 1 页 共 1 页 第8章 双水相萃取技术1 双水相萃取现象：最早是1896年由Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象称之为聚合物的“不相溶性”。

70年代中期西德的Kula 和Kroner 等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大地改善了胞内酶的提取效果。

双水相萃取技术：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。

利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质进行物质分离的方法称双水相萃取技术，又称水溶液两相分配法。

2 双水相萃取技术基本原理：①双水相的形成—聚合物的不相容性：混合是熵增加的过程，可自发进行。

但是，分子间的相互作用力也会随分子量的增大而增大。

当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于分子量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。

这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。

双水相的形成—系统举例：绝大多数天然的或合成的亲水性聚合物水溶液，在与第二种亲水性聚合物混合，并达到一定浓度时，就会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。

如用等量的1.1％右旋糖酐溶液和0.36％甲基纤维素溶液混合，静止后产生两相，上相中含右旋糖酐0.39％，含甲基纤维素0.65％；而下相含右旋糖酐1.58％，含甲基纤维素0.15％。

聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG ／磷酸钾、PEG ／磷酸铵、PEG ／硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。

PEG ／无机盐系统的上相富含PEG ，下相富含无机盐。

Dextran-PEG 体系的相图：（1）TKB 称为双节线，双节线以下的区域为均相区， 以上的区域为两相区。

（2）TMB 称为系线，是连接双节线上两点的直线，在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。

三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。

分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。

3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。

由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。

在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。

萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。

用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。

双水相萃取技术（two-aqueous phase extraction）一、前言近年来，随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。

与上游过程相比，目前作为下游过程的生化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了生物技术的工业化发展。

因此，就迫切需要一种分离步骤少，收得率高，处理时间短，并且易于放大的生化分离纯化技术，双水相萃取技术就满足了这一需要。

特别是基因工程技术的发展，需要从细胞中提取高质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在大量的轻质细胞碎片，给遗传物质的提取形成了很大的干扰，通常通过离心分离和溶剂萃取难以得到高纯度高活性的遗传物质，而通过双水相初步提取，可以使目标物和轻质碎片得到很好的分离，且目标物的活性几乎没有损失。

因此双水相萃取技术得到了很大的重视，并且在近20年里取得了较大的发展。

二、发展史双水相萃取技术又称之为水溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）――――体系的发现2、1956年瑞典伦得（Luhd）大学的Albertson发现双水相萃取技术可用于蛋白质的选择分离，但目标蛋白同成相高聚物的分离是影响了其大规模工业应用。

――――――――――发现可以用于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，从而大大改善了胞内酶的提取过程，提高了酶的收得率。

―――――――利用于活性物质的提取4、1989年，Diamond等人以Flory－Huggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。