饲料中毒素分析化验方法

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饲料中毒素分析化验方法

一、毒素检测方法依据

1、黄曲霉素检测依据

GB/T5009.23-2006《食品中黄曲霉素B1、B2、G1、G2的测定》

GB/T8381-2008《饲料中黄曲霉素B1的测定半定量薄层色谱法》

2、T-2毒素检测依据

GB/T23501-2009《食品中T-2毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》

GB/T8381.4-2005《配合饲料中T-2毒素的测定薄层色谱法》

3、玉米赤霉烯酮检测依据

GB/T23504-2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》

GB/T19540-2004《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》

4、赭曲霉毒素A检测依据

GB/T23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》

GB/T19539-2004《饲料中赭曲霉毒素A的测定》

5、脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测依据

GB/T23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》

GB/T8381.6-2005《配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法》

二、所需仪器和试剂

1、试剂

色谱纯试剂:甲醇、乙腈、冰乙酸

标准品试剂:玉米赤霉烯酮标准品、T-2毒素标准品、黄曲霉素B1、B2、G1、G2标准品、赭曲霉素A标准品、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)标准品

分析纯试剂:无水乙醇、石油醚(30℃-60℃,60℃-90℃)、乙酸乙酯、丙酮、硅胶G、三氯甲烷、羧甲基纤维素钠、苯、无水乙醚、中性氧化铝、活性炭、甲酸、正己烷、三氟乙酸、无水硫酸钠、硫酸、磷酸、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-蒽腈、碳酸氢钠、吐温-20、聚乙二醇

2、仪器

液相色谱仪(二元梯度高压恒流泵、荧光检测器、紫外检测器、柱温箱)、空气泵、氮吹仪、旋转蒸发器(500mL、250mL)、电动震荡器、分液漏斗、层析柱(内径20mm,长100mm;内径22mm,长300mm;)、玻璃纤维滤纸(直径11厘米,孔径1.5μm)、阀门注射器(玻璃材质)

三、提取方法

由于饲料中毒素检测中都是用免疫亲和柱提纯毒素造价比较高(一种毒素一次使用一个免疫亲和柱价格至少为100元),所以用化学试剂进行提纯,以降低检测的费用,节约成本。

1、黄曲霉素提取

样品脂肪含量超过5%,先进行石油醚脱脂,称取50.000g试样,加25g硅藻土,加入25mL水、250mL三氯甲烷,加塞密封震荡30min,过滤,弃去初液10mL,吸取滤液50mL于250mL锥形瓶内,加入100mL正己烷混合,将混合液定量的加入至层析柱内(2/3体积的三氯甲烷于层析柱中,加入5g硫酸钠,分次加入10g硅胶,静止15min,再小心的加入10g硫酸钠,打开活塞让液体流出直至液面在硫酸钠层的表面,关闭活塞),打开活塞,是液体以8mL/min-12mL/min流速流出,直至液体在硫酸钠的液面上,关闭活塞,加入100mL乙醚,再打开活塞,直至液面下降至硫酸钠的液面上,保证柱内不干。用150mL三氯甲烷-甲醇(97+3)溶液洗脱柱子,收集全部洗脱液旋转蒸发(惰气保护,50℃),残渣溶解

2、T-2毒素提取

称取20.000g试样,置200mL具塞锥形瓶中,加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(8+2)密塞,在瓶塞上涂层水,盖严防漏。振荡1h,通过折叠快速定性滤纸过滤,取25mL滤液于100mL蒸发瓶中,置旋转蒸发器上45℃减压蒸发至干。用100mL石油醚分次溶解蒸发瓶中的残渣,入250mL分液漏斗中,再用30mL甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发瓶,转入同一分液漏斗。振摇分液漏斗1.5 min,静置约15min,使分层后,将下层甲醇-水提取液过净化柱,不要将两交界处的白色絮物放人柱内。在层析柱(内径2cm,长10cm)下端塞约1g脱脂棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性氧化铝(层析用,经300℃活化4h,置干燥器中备用),敲平表面,再加入0.5g活性炭(酸洗),敲紧。将层析柱下端插人胶塞,塞在抽滤瓶上,抽滤瓶中放入一平底管接收流出液。打开真空泵,使活性炭压紧,将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加人柱内,控制流速不超过3 mL/min,提取液过柱快完毕时,加人10ml甲醇-水淋洗柱,继续抽滤,直至不再有液体流出。过柱后的流出液转入100mL蒸发瓶中,置旋转蒸发器上,45℃减压蒸发至干。取下蒸发瓶置沸水浴上至完全干燥,趁热加人3ml乙酸乙酯,加热至沸腾,在水浴上轻轻地反复摇动蒸发瓶,使残渣中的T-2毒素溶出,冷却至室温后转人浓缩瓶中。加约0.5mL甲醇-丙酮(1+2)于蒸发瓶中,超声破碎残渣,将蒸发瓶置水浴上挥干溶剂后,加人3 mL乙酸乙酯,加热至沸,转动蒸发瓶,使充分沸腾,冷却至室温后转人同一浓缩瓶中,再用0.5mL甲醇-丙酮和3mL乙酸乙酯同样处理一次,乙酸乙酯并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置约95℃水浴上,蒸汽加热浓缩至干,冷却至室温后,准确加人0.2

mL丙酮溶解残渣。

3、玉米赤霉烯酮提取

称取约20.000g试样,置于具塞锥形瓶中,加人8mL水和100mL三氯甲烷,盖紧瓶塞,在振荡器上振荡1h,加入10g无水硫酸钠,混匀,过滤,量取50mL滤液于分液漏斗中,沿管壁慢慢地加人氢氧化钠溶液(40g/L)10mL,并轻轻转动1min,静置使分层,将三氯甲烷相转移至第二个分液漏斗中,用氢氧化钠溶液10mL,重复提取1次,并轻轻转动1min,弃去三氯甲烷层,氢氧化钠溶液层并人原分液漏斗中,用少量蒸馏水淋洗第二个分液漏斗,洗液倒人原分液漏斗中,再用5mL三氯甲烷重复洗2次,弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠溶液层中加人6mL磷酸溶液(1+10)后,再用磷酸溶液(1+19)调节pH值至9.5左右,于分液漏斗中加人15ml三氯甲烷,振摇,将三氯甲烷层经盛有约5g无水硫酸钠的慢速滤纸的漏斗中,滤于浓缩瓶中,再用15mL三氯甲烷重复提取2次,三氯甲烷层一并滤于浓缩瓶中,最后用少量三氯甲烷淋洗滤器,洗液全部并于浓缩瓶中,真空浓缩至小体积,将其全量转移至具塞试管中,在氮气流下蒸发至干,用2mL三氯甲烷溶解残渣。

4、赭曲霉毒素A提取

称取约20.000g试样,置于具塞锥形瓶中,加30mL石油醚和100mL甲醇溶液(55+45),瓶塞盖紧。振荡30min后,通过快速定性滤纸滤人分液漏斗中,待分层后,放出甲醇水层20mL.置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为5-6。加人25mL三氯甲烷,振摇2min,静置分层后,放出三氯甲烷层于另一个分液漏斗中,再用10 mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水层(在用三氯甲烷振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醇促使其分层),将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加人50mL-100mL氯化钠溶液(40g/L),振摇,放置分层后,将三氯甲烷层放出,经装有约20g无水硫酸钠的玻璃漏斗流人蒸发皿中,将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转人浓缩瓶中,置60℃水浴减压浓缩至干,加人2mL苯-冰乙酸(99+1)溶解残渣。

5、脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取

称取20.000g试样,置200mL具塞锥形瓶中,加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(8+2)密塞,在瓶塞上涂层水,盖严防漏。振荡1h,通过折叠快速定性滤纸过滤,取25mL滤液于100mL蒸发瓶中,置旋转蒸发器上45℃减压蒸发至干。用100mL石油醚分次溶解蒸发瓶中的残渣,洗人250mL分液漏斗中,再用30mL甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发瓶,转人同一分液漏斗。振摇分液漏斗1.5 min,静置约15min,使分层后,将下层甲醇-水提取液过净化柱,不要将两交界处的白色絮物放人柱内。在层析柱(内径2cm,长10cm)下端塞约1g脱脂棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性氧化铝(层析用,经300℃活化4h,置干燥器中备用),敲平表面,再加入0.5g活性炭(酸洗),敲紧。将层析柱下端插人胶塞,塞在抽滤瓶上,抽滤瓶中放入一平底管接收流出液。打开真空泵,使活性炭压紧,将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加人柱内,控制流速不超过3 mL/min,提取液过柱快完毕时,加人10ml甲醇一水淋洗柱,继续抽滤,直至不再有液体流出。过柱后的流出液转入100mL蒸发瓶中,置旋转蒸发器上,45℃减压蒸发至干。取下蒸发瓶置沸水浴上至完全干燥,趁热加人3ml乙酸乙酯,加热至沸腾,在水浴上轻轻地反复摇动蒸发瓶,使残渣中的T-2毒素溶出,冷却至室温后转人浓缩瓶中。加约0.5mL甲醇-丙酮(1+2)于蒸发瓶中,超声破碎残渣,将蒸发瓶置水浴上挥干溶剂后,加人3 mL乙酸乙酯,加热至沸,转动蒸发瓶,使充分沸腾,冷却至室温后转人同一浓缩瓶中,再用 0.5mL甲醇-丙酮和3mL乙酸乙酯同样处理一次,乙酸乙酯并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置约95℃水浴上,蒸汽加热浓缩至干,冷却至室温后,准确加人0.2 mL三氯甲烷-乙腈溶解残渣。

四、毒素的液相色谱分析方法

毒素名称 T-2毒素 黄曲霉素 玉米赤霉烯酮 赭曲霉毒 脱氧雪腐镰刀菌烯醇

检测器 荧光检测器 荧光检测器 荧光检测器 荧光检测器 紫外检测器

色谱柱 C18 5μm

150mm*4.6mm C18 5μm

125mm*2.1mm C18 5μm

150mm*4.6mm C18 5μm

150mm*4.6mm C18 5μm

150mm*4.7mm

流动相 乙腈+水=75+25 乙腈+水梯度洗脱 乙腈+水+甲醇=46+46+8 乙腈+水+冰乙酸=99+99+2 甲醇+水=20+80

流速 1.0mL/min 0.5mL/min 1.0mL/min 0.9mL/min 0.8mL/min

柱温 35℃ 30℃ 35℃ 35℃ 35℃

检测器

波长 激发波长381nm

发射波长470nm 激发波长360nm

发射波长440nm 激发波长274nm

发射波长440nm 激发波长333nm

发射波长477nm 波长218nm

衍生剂 4-二甲基氨基吡啶、1-蒽腈 正己烷、三氟乙酸 无 无 无

洗脱 甲醇 无 甲醇 甲醇 甲醇