Spindlin1蛋白在小鼠卵细胞中的功能分析
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Spindlin1蛋白在小鼠卵细胞中的功能分析南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明和使用授权声明独创性声明本论文亚i坠亟!i垒!蛋鱼查!』：氲!已纽照主鲍麴丝塑窒是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
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专业：塑丛魈墼作者签名：鑫监El期：垒&：垒厶论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。
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作者签名：鸯魅菸导师签名：南京医科大学硕士学位论文中文摘要纺锤体组装检测点(SAC)在哺乳动物体内，是一种普遍存在的、非常重要的调控机制。
它在体细胞有丝分裂的过程中，可以防止出现染色体的不分离以及细胞的死亡。
任何一条染色体未能正确附着在双极纺锤体上都将激活该检测点，使细胞分裂停滞在中期，从而为细胞修复这种错误赢得时间。
在减数分裂中，纺锤体组装检测点同样发挥着重要作用。
已有研究证明，在有丝分裂中参与SAC调控的一些关键蛋白，如MAD、BUB等，在减数分裂中也发挥着相似的作用。
尽管如此，作为一种特殊的分裂形式，它的调控是否有别于体细胞的有丝分裂?是否存在着特殊的作用途径?目前为止，这些问题都不清楚。
而通过本研究，我们发现了一种潜在的参与SAC调控的卵细胞特异的蛋白--spindlinl蛋白。
在前期工作中，本实验室利用二维电泳和质谱鉴定等蛋白质组学技术建立了小鼠MetII期(第二次减数分裂中期)卵细胞的蛋白表达谱。
这部分数据可以通过下列网址直接访问(http：／／reprod．njmu．edu．cn／2d)。
Spindlinl就是在该谱系中鉴定得到的蛋白之一。
在这个谱系中，共有10个蛋白点被鉴定为spindlinl蛋白，它们分布于不同的分子量和等电点(高丰度的点大致集中在27kD 和29kD两个分子量水平)，这提示我们该蛋白在小鼠卵细胞中具有非常复杂的功能形式。
在本次研究中，我们再次利用二维电泳获得激活后卵细胞的2D胶，并与之前正常卵细胞的2D胶进行比对，结果发现位于29kD处的5个spindlinl蛋白点从激活后卵细胞的胶上消1南京医科大学硕士学位论文失，而位于27kD处的1个蛋白点其表达则显著上调。
接着，我们用磷酸化染料对激活前卵细胞的2D胶进行染色，结果发现激活后消失的5个蛋白点均存在磷酸化形式．这说明spindlinl蛋白在卵细胞激活后存在去磷酸化的改变，这种改变可能导致该蛋白在卵细胞激活后丧失活性。
为了能够进一步研究该蛋白的功能，我们通过传统的原核表达、蛋白纯化、动物免疫等方法获得spindlinl抗体，并分$'J工AWestern blot、免疫组化、免疫荧光三个方面对抗体的特异性进行验证。
我们用制得的抗体对纯化的spindlinl蛋白进行Western blot检测，结果在理论大小处获得一条特异的融合蛋白目的条带。
另外免疫组化乖免疫荧光的结果显示，spindlinl蛋白主要定位在卵细胞的胞浆和纺锤体上，这与前人的报道一致。
上述结果均证明，我们制备的spindlinl抗体是特异的并且是有效的。
本研究着重探讨了spindlinl蛋白在小鼠卵细胞中表达、定位的变化以及与之相关的生物学功能。
首先，我们通过Western blot的方法研究激活前后卵细胞中spindlinl蛋白的表达水平，结果发现该蛋白在激活前后卵细胞中的表达总量没有改变。
另外，免疫荧光的结果证明，该蛋白仅定位于卵细胞的中期纺锤体上，并且与a-mbulin蛋白共定位；而到分裂后期则从纺锤体上消失。
这种定位的变化提示我们，spindlinl蛋白可能仅在分裂中期发挥作用。
为了直接观察该蛋白的生物学功能，我们利用显微注射的方式将spindlinl的抗体导入MetlI期卵细胞胞浆中，进而观察纺锤体的形态以及染色体的分布。
结果发现：正常的中期纺锤体结构被破坏，形成单极纺锤体、长形纺锤体、椭圆形纺锤体；同时出现了严重的染色体排列紊乱。
该结果有力地证明，在MetlI期卵细胞中，spindlinl是维持纺锤体形态以及染色体排列的一种重要蛋白。
接着，我们用氯化锶激活注射后的卵细胞，并通过活细胞工作站适时观察分裂的进程。
结果显示抗体组卵细胞其后期启动以及第二极体排放的速度均明显快于对照组。
根据上述一系列研究结果，我们推断spindlinl蛋白是维持中期纺锤体的一种重要蛋白，同时它参与了卵细胞减数分裂中SAC的调控；而在激活胶上消失的磷酸化的点可能就是该蛋白发挥生物学功能的活性形式。
关键词：纺锤体组装检测点(SAC)，中期阻滞，spindlinl蛋白；减数分裂Ab stractIn mammalian，the spindle assembly checkpoint(SAC)is an important safety device which prevents chromosome mis—segregation and cell death in mitosis．The presence of a single chromosome erroneously attached the biopolar-spindle can activated the SAC and lead to a metaphase arrest to permit the reparation of the‘damage’．In meiosis，the SAC control has been verified to be functional and some SAC components，such as MAD and BUB，are necessary for correct timing of premetaphase in mouse oocytes．However,the SAC mechanism in oocyte meiosis is stil l ambiguous．In this research，we have discovered a potential oocyte—specific protein involving in SAC control——spindlin 1．In previous research，we utilized the proteomics to determine the expression of proteins in mouse oocyte and generated a proteome reference database for MetlI(metaphase of the second meiotic division) mouse oocyte，which can be accessed over the Intemet(http：／／reprod．njmu．edu．cn／2d)．Among these，ten protein spots were identified as spindlinl by mass spectrometry,which distribute at different molecular mass(Mr)and isoelectric point(pI)，suggesting its functional complexity in mouse oocyte．When the oocytes were activated by strontium chloride for three hours，five protein spots vanished from the image．The result implied that the protein may be involved in some4MetII biological events at the specific stage．Then we stained the 2D gel ofoocytes with a fluorescently labeling Pro-Q Diamond dye and visualized the phosphorylated proteins．The image shows that an vanished protein spots were modified by phosphorylation，which meansthat phosphorylation is the functional pattern of spindlin l at metaphase stage．To study the function of spindlin l protein，we prepared anti—spinWestern blot，antibody and verified its specificity byimmunohistochemistry and immunofluorescence．The result of Western blot displayed that there were a single band at the position of expected molecular mass．At the same time，the consequences of immunohistochemistry and immunofluorescence showed that spindlin l protein was present in the cytoplasm of oocytes and localized to the metaphase spindle，which were concordant with the researches reported before．The data above proven that anti—spin antibody is specific and effective．The current research was focus on the localization variation of spindlin l protein and its associated function in mouse oocyte．To confirm the spatial relationship between spindlin l and 0【．tubulin，double immunostaining was performed．The result showed that spindlin l protein localized to the metaphase spindle，colocalizing with 0【一tubulin protein，but not anaphase spindle．TO explore the role of spindlinl directly,MetlI5oocytes weremicroinjected with anti —spin antibody,which leading to obvious spindle abnormalities and chromosomes congression failure ．The result demonstrates strongly that spindlin l protein is very important formaintaining normal spindle appearance inMetlI ．Then the microinj ectedoocytes were activated with strontium chlorideand the division process was investigated by time lapse video ．The anaphase onset and second polarbody extrusion were sped up conspicuously due to reduction of spindlin l levels ．Base on the consequences above ，we considered that spindlinl protein is very important for maintaining normal metaphase spindle ．Besides ， spindlin l may be involved in the SAC control ；the vanished protein spots from the gel when the oocytes were activated may be associated with the proper function binding to the spindle ．Keywords ：spindle assembly checkpoint(SAC)；metaphase arrest of MII ；spindlinl ；meiosis6南京医科大学硕士学位论文前言有丝分裂是受一系列复杂生物学事件调控的生理过程，根据形态学特征人为地划分为前期、前中期、中期、后期和末期5个时期。
