布鲁菌外膜蛋白的糖基化及免疫效果检测

专利名称：一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法专利类型：发明专利
发明人：杜志强,王建英,张雪峰
申请号：CN201310403116.5
申请日：20130906
公开号：CN103675289A
公开日：
20140326
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，属于免疫学的技术领域。

本发明利用重组布鲁氏菌Omp19外膜蛋白作为抗原蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过免疫印迹试验进行人或者家畜动物血清的免疫识别，根据免疫印迹的结果可以直接判断人与家畜体内是否存在布鲁氏菌。

本发明可以作为检测人或者家畜体内是否存在布鲁氏菌的重要方法，在我国广大农牧业养殖区的布鲁氏菌病的快速、准确检测方面有较大的应用空间。

申请人：内蒙古科技大学
地址：014010 内蒙古自治区包头市昆区阿尔丁大街7号
国籍：CN
代理机构：包头市专利事务所
代理人：庄英菊
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布鲁氏菌主要外膜蛋白特征及其应用研究进展
王锐;王占黎;丁海涛;邹昊
【期刊名称】《包头医学院学报》
【年(卷),期】2022(38)1
【摘要】布鲁氏菌病是一种人畜共患传染病。

外膜蛋白是布鲁氏菌重要的毒力因子,同时具有较好的免疫原性,能够刺激机体产生较强的免疫力,可以作为布鲁氏菌病诊断的抗原和布鲁氏菌病亚单位疫苗的候选物。

本文对目前几种重要的布鲁氏菌外膜蛋白相关研究进展进行综述,以期进一步了解布鲁氏菌外膜蛋白的特性,为研制布鲁氏菌病的诊断试剂及相关疫苗提供参考价值。

【总页数】5页(P92-96)
【作者】王锐;王占黎;丁海涛;邹昊
【作者单位】内蒙古医科大学;内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室;内蒙古自治区人民医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】S85
【相关文献】
1.布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展
2.犬种布鲁氏菌外膜蛋白的特性及宿主牦牛及其外膜蛋白的影响
3.基于布鲁氏菌外膜蛋白OMP28的ELISA检测试剂盒的研制与应用
4.布鲁氏菌外膜蛋白的研究——Ⅲ.牛种、羊种布鲁氏菌非典型株外膜蛋白SDS—PAGE图谱的特点
5.布鲁氏菌外膜蛋白的研究——Ⅱ.牛、羊、猪三种布鲁氏菌光滑型菌株外膜蛋白SDS-PAGE图谱的比较
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布鲁氏菌病PCR检测的临床意义姚馨月;郑文艳【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2016(048)002【总页数】4页(P189-192)【关键词】布鲁氏菌;PCR;诊断【作者】姚馨月;郑文艳【作者单位】内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特010059;中国人民解放军第253医院感染科,内蒙古呼和浩特010010【正文语种】中文【中图分类】R378.5布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染-变态反应性疾病[1]。

世界动物卫生组织(OIE)将其列为重要传染病，属于《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中二类传染病中之首[2～4]。

布病在我国的整体流行趋势呈现出老疫区死灰复燃，新疫区范围扩大[5]。

布鲁氏菌病潜伏期为1～3周，初期症状类似重感冒，如发热、关节疼痛、疲劳、乏力、多汗、肝脾肿大等症状。

临床症状极不典型，在诊疗过程中易造成误诊，急性期布病如不及时诊断极易发展为慢性期。

慢性布病患者往往都会伴有不同程度的骨关节系统病变[6]。

本病的致命性并发症为中枢神经系统病变及心肌病变[7]。

所以布病的早期诊断，就变的尤为重要。

我国CDC布病诊断标准为：(1)流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物、布鲁菌培养物等，或生活在疫区的居民；(2)临床症状和体征排除其他疑似疾病；(3)实验室检查：病原分离、试管凝集实验、补体结合实验、抗人球蛋白阳性。

凡具备第(1)、(2)项和第(3)项中的任何一项检查阳性即可确诊为布病。

布病的实验室检查方式是确诊布病的关键证据。

诊断布病的“金标准”是病原分离，但病原分离要求在P3级生物实验室进行，对实验室操作人员有较高的专业技术要求，耗时长，最终的菌落形态不易辨认，且有明显的操作暴露危险，增大医源性感染的可能。

在基层不易推广。

培养的阳性率极低。

1.1 凝集实验SAT一直是各国用作诊断布病的常规血清学诊断方法，我国更是将其列为了诊断布病的法定检测方法[8]。

·研究论文·摘 要：为建立一种检测布鲁菌抗体的间接ELISA 检测方法，本研究对Irr 蛋白进行生物信息学分析、原核表达，用纯化的重组蛋白Irr 作为包被抗原，建立了一种检测布鲁菌抗体的间接 ELISA 方法。

结果显示，重组蛋白Irr 包被量为0.25 μg ，5％脱脂奶粉封闭2 h ，一抗稀释浓度1∶500孵育2 h ，二抗稀释浓度1∶5000孵育2 h ，显色15 min 时建立的间接ELISA 方法条件最优，该方法的OD 450临界值为0.55，与凝集实验的符合率达到96.7%，同时具有较好的特异性和重复性。

以上结果表明，本研究基于Irr 蛋白建立了操作简单、特异性高、重复性好的血清学间接ELISA 检测方法，为布鲁菌病的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

关键词：布鲁菌；Irr 蛋白；原核表达；生物信息学；间接ELISA 方法中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0057-10Bioinformatics Analysis, Expression and Purifi cation of Brucella Irr Protein andPreliminary Establishment of ELISA MethodSUN Tianhao 1, ZHANG Qian 2,3, CAO Xudong 2, LI Nan 1, CHENG Kejian 1, ZHANG Jiangwei 1,WANG Zhen 1,2, CHEN Chuangfu 1,2(1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Xinjiang 832000, China; 2. Co-Innovation Center for Zoonotic Infectious Diseases in the western region, Shihezi University, Xinjiang 832000, China; 3. Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Xinjiang 832000, China)布鲁菌Irr 蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA 方法的初步建立孙天浩1，张 倩2,3，曹旭东2，李 楠1，程科建1，张江伟1，王 震1,2，陈创夫1,2（1.石河子大学动物科技学院，石河子832000；2.西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，石河子832000；3.新疆农垦科学院，石河子832000）Abstract: In order to establish an indirect ELISA method for detecting Brucella antibodies, this study performed bioinformatics analysis and prokaryotic expression of Irr protein, and used purified recombinant protein Irr as the coating antigen to establish a method for detecting Brucella Indirect ELISA method for antibodies. The results showed that the coating quantity of recombinant protein Irr was 0.25 μg, 5% skimmed milk powder was blocked for 2 h, the primary antibody dilution concentration was 1:500 and incubated for 2 h, the secondary antibody dilution concentration was 1:5000 and incubated for 2 h, and the color development was 15 min. Optimally, the critical value of this method is OD 450 0.55, and the coincidence rate with the agglutination experiment reaches 96.7%, which also has good specifi city and repeatability. In summary, this study established a serological indirect ELISA detection method based on Irr protein with simple operation, high specifi city and good reproducibility, which provided technical support for the diagnosis and epidemiological investigation of brucellosis.Key words: Brucella ; Irr protein; prokaryotic expression; bioinformatics; ELISA收稿日期：2021-06-15基金项目：国家自然科学基金项目（31760020，U1803236）作者简介：孙天浩，男，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治研究；张倩，女，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断与防治研究通信作者：王震，E-mail：******************.cn；陈创夫，E-mail：**************Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2023,31(4):57-66· 58 ·中国动物传染病学报2023年8月布鲁菌病（Brucellosis），是由胞内生存的布鲁菌引起的一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病，其可以引起人的波浪热，母畜流产以及公畜睾丸炎等症状，严重阻碍畜牧业的发展和公共卫生安全[1]。

布鲁氏菌的血清学检测方法布鲁氏菌病（简称布病）是一种人兽共患的传染病，世界范围内流行。

布病给人造成了大量损失和痛苦。

近年由于布病的散发病例的增多，患者多无明确接触史，临床症状又不典型，因此其实验室检测至关重要。

目前布氏菌的实验室检测主要分三类：布氏菌细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测。

细菌学检测周期长、阳性率低、感染风险高等特点，分子生物学对仪器、人员、技术的要求较高使得这两类技术在临床诊断应用上不是很普遍，应用最多的还是布氏菌的血清学检测。

本文现就布氏菌的血清学的检测进行如下综述。

布氏菌血清学方法可以分为：凝集法、补体结合法、酶联免疫吸附试验法、荧光偏振法、胶体金层析法等。

其中凝集法是通过特异性抗体与颗粒性抗原结合产生凝集的血清学实验，现应用最多的为虎红平板凝集实验、试管凝集实验、二巯基乙醇试管凝集实验、抗人球蛋白抗体实验等。

虎红平板凝集实验（RBPA）其抗原系用抗原性良好的牛种布氏菌株在适宜培养基上培养收获菌体, 经加热灭活, 离心后用虎红染料染色, 悬浮于乳酸缓冲液（PH3.6-3.7）制成。

它能抑制非特异性反应的IgM和增强特异性IgG 的活性, 其反应敏感稳定, 特异性优于试管凝集实验。

因此PBPA在很多国家推广使用, 是我国常规的诊断方法之一。

RBPA操作简单，不需要大型精密的仪器，适合基层医疗机构和检测点应用。

因有很高的灵敏性且能在短时间内完成，RBPA常用于初筛实验。

其有很高的准确性，特别是当检测1:4稀释血清标本阳性时其诊断的特异性更高【1】。

但RBPA也有局限性，纤维蛋白原可与虎红染料发生非特异性结合形成假阳性【2】，急性病人早期，体内产生的抗体以IgM为主，RBPA可能检测为阴性。

试管凝集实验(SAT)又称莱特试验是1897年由Wright发明，其方法简便，特异性强，可半定量检布鲁氏菌抗体滴度，因此有很高的诊断价值，至今在临床上广泛使用。

我国布病诊断标准中当SAT滴度≥1：100可确诊是活动性布病。

布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察高永辉;张松乐;曾政;罗德炎;张良艳;董梅;王希良【期刊名称】《中华地方病学杂志》【年(卷),期】2006(025)001【摘要】目的比较布鲁杆菌6种抗原表位所获得的基因工程疫苗的免疫保护效率.方法布鲁杆菌核糖体蛋白L7/L12、胞质蛋白P39、细胞表面蛋白BCSP31、二氧四氢喋啶合成酶BLS、16.5×103的外膜蛋白PAL和翻译起始因子IF3的基因片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建的核酸疫苗及上述6条片段转入pET32a(+)后诱导表达的的重组蛋白免疫小鼠,3次免疫后进行攻毒实验,对其免疫保护效率进行初步观察.结果L7/L12和BLS的重组蛋白疫苗和核酸疫苗都产生了非常显著的保护作用,P39的核酸疫苗、IF3和BCSP31的重组蛋白疫苗也产生了非常显著的保护作用,其中L7/L12核酸疫苗的保护效率最高.结论初步认为布鲁杆菌的优势抗原表位所获得的基因工程疫苗可产生一定的抗布鲁杆菌作用,可作为未来布鲁杆菌新型疫苗的候选者,有进一步研究的价值.【总页数】4页(P46-49)【作者】高永辉;张松乐;曾政;罗德炎;张良艳;董梅;王希良【作者单位】100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室免疫室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.鸡传染性支气管重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LHB株病毒攻击的免疫保护[J], 石星明;王云峰;王玫;刘胜旺;童光志;徐灵龙;贺笋2.猪口蹄疫O型基因工程疫苗免疫保护试验 [J], 赵利平;刘玉梅;刘国英;郑兆鑫3.鸡传染性支气管炎病毒重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95I株病毒攻击的免疫保护 [J], 王云峰;石星明;王玫;刘胜旺;童光志;何来;贺笋;崔红玉;李一经4.鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LT95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护 [J], 石星明;王玫;王云峰;杨桂花;孙鹏;李继松;曾伟伟;刘胜旺5.PEDV基因工程亚单位疫苗对仔猪的免疫保护试验 [J], 洪树彬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同方法检测布鲁氏菌抗体的对比评价布鲁氏菌是一种引起动物和人类布鲁氏病的细菌，可以通过感染动物、食用感染物或与感染动物接触等多种途径被人体感染。

因此，对布鲁氏菌的检测非常重要，而检测布鲁氏菌抗体是检测布鲁氏病的常用方法之一。

目前，常用的检测布鲁氏菌抗体的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、血凝试验（CFT）和微量补体结合试验（MCT）。

本文将对这三种方法进行对比评价。

一、酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是一种高灵敏度、高特异性、快速、简便且能同时处理多个样品的检测方法。

它通过将具有抗原性质的蛋白质与试验液中的抗体结合，在试验中加入特定酶标记的二抗以形成抗原-抗体-酶复合物，通过检测酶标记的颜色变化量，可以确定样品中抗体的含量。

该方法具有操作简便、适用范围广、检测结果可靠等优点。

目前，ELISA已成为检测布鲁氏菌抗体的首选方法。

二、血凝试验（CFT）CFT是一种检测抗体的传统方法，其原理是将受检血清与布鲁氏菌抗原混合，通过抗原-抗体结合导致血清发生凝集反应，并测定凝集的程度来判断血清中抗体的含量。

该方法具有适用于样品种类广泛、操作简单、成本低等优点。

但是，该方法存在许多缺点，如需要长时间的反应和读取时间、试剂稀释的影响等，同时凝集反应的灵敏度较差，不适用于抗体浓度低的检测。

因此，CFT主要应用于筛查试验和流行病学调查。

三、微量补体结合试验（MCT）MCT是一种通过测定受检物中微量补体结合反应来检测抗体的方法。

这种方法与CFT相比，具有操作简单、结果快速、准确度高等优点，特别是对于婴儿和孕妇等抗体含量较低的样品具有较好的检测效果。

但是，该方法的灵敏度较高，需要特别的设备和试剂，成本比较昂贵。

此外，MCT不适用于大规模筛查，对于复杂的临床情况分析也不够直观。

总之，针对不同的检测需求和实际应用场景，选择不同的检测方法是非常必要和重要的。

当需要进行大规模、快速、高效、准确的检测时，ELISA将是最好的选择；CFT则可用于筛查和流行病学调查；而对于抗体含量较低的样品，MCT则更适用。