_L_鼠李糖苷酶发酵过程放大研究_从5L到30L发酵罐

重组鼠李糖乳杆菌发酵L-乳酸的初步研究郭铃;孙靓;李检秀;吴军华;黄艳燕;孙菲菲;黄日波【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2011(000)006【摘要】将自杀质粒pDT转化到鼠李糖乳杆菌JCM 1553中,成功获得了具有四环素抗性的鼠李糖乳杆菌.生长曲线说明,重组菌株能在5 μg/mL四环素MRS培养基中正常生长,最适培养温度为37～42℃.重组菌株在含有10％、15％、20％、25％的葡萄糖发酵培养基中的发酵结果显示:37℃,200 r/min发酵40～88 h,菌体密度OD600最大为29.05;残糖含量最低为0.604％,L-乳酸的最大产量为228.19g/L,葡萄糖转化率最大为96.24％.【总页数】4页(P21-24)【作者】郭铃;孙靓;李检秀;吴军华;黄艳燕;孙菲菲;黄日波【作者单位】广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院,广西南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007;广西科学院,广西南宁530007【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;Q81【相关文献】1.耐糖鼠李糖乳杆菌发酵生产L-乳酸的研究 [J], 于雷;裴晓林;雷霆2.离子注入诱变筛选高产L-乳酸菌及其发酵条件的初步研究 [J], 刘勇军;王昌禄;乐晓洁;于志平;曹伟锋3.固定化乳酸菌发酵制备L-乳酸的初步研究 [J], 韩玉洁;陈晔;孔琪;徐忠;谢应根4.嗜热乳酸杆菌l-乳酸发酵条件的初步研究 [J], 高年发;石青松;杨慧灵;杨枫5.产L-乳酸凝结芽孢杆菌发酵条件的初步研究 [J], 周剑;虞龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶发酵的影响马骏;魏春;汪钊【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)006【摘要】α-L-鼠李糖苷酶是工业上一种重要的水解酶.为了方便地优化和监控α-L-鼠李糖苷酶的发酵生产过程,在5L发酵罐水平研究黑曲霉菌丝体活力与α-L-鼠李糖苷酶产量之间的关系,菌丝体活力采用TTC-脱氢酶法进行测定.实验结果表明,在发酵过程中维持适宜的菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶的产量非常重要:当摇瓶种子菌丝体活力达到最大值0.388 U/mL时,对应的5L发酵罐中α-L-鼠李糖苷酶的产量最大；控制发酵过程的pH恒定于5.5,可以有效延缓菌丝体活力下降速度,使α-L-鼠李糖苷酶的产量提高28.7％；当搅拌转速低于400r/min或通气量低于0.3 vvm时,发酵24 ～ 36 h的菌丝体活力大幅下降,α-L-鼠李糖苷酶的产量显著降低.因此,可以将菌丝体活力作为α-L-鼠李糖苷酶发酵工艺优化和生产过程控制中一项重要的监控参数.【总页数】5页(P23-27)【作者】马骏;魏春;汪钊【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014【正文语种】中文【相关文献】1.培养基组成及发酵条件对黑曲霉变种产α-半乳糖苷酶的影响 [J], 许尧兴;李艳丽;许少春;柳永;姚晓红2.米根霉不同菌丝体形态对重复间歇发酵生产L-乳酸的影响 [J], 郑志;杜威;姜绍通;吴学凤;李兴江;罗水忠;张任远3.发酵产物对灰绿曲霉β-葡萄糖苷酶活力的影响 [J], 许鑫琦;任跃明;马素娟;龙敏南;陈清西4.溶氧对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵的影响 [J], 肖玲玲;张超;龚大春5.溶氧对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵的影响 [J], 肖玲玲;张超;龚大春;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

O L—L一鼠李糖苷酶发酵过程放大研究——从5L到30L发酵罐张雪铭1，马骏2。

魏春3，应向贤3，汪钊3(1．浙江省天正设计工程有限公司，浙江杭州310012：2．浙江海正药业股份有限公司。

浙江台州318000；3．浙江工业大学生物与环境工程学院。

浙江杭州310014)摘要：以产a-L-鼠李糖苷酶(a—L一1，2一鼠李糖苷酶和a—L一1，6一鼠李糖苷酶)的黑曲霉A5．per gi l l us ni ger W Z001为考察对象，研究了从5L发酵罐到30L发酵罐的通气量和搅拌转速的放大工艺。

通气量按三种准则、搅拌转速按两种准则放大。

通过实验验证，优选得到最佳放大准则为：通气量按1．5倍空气表观线速度进行放大、搅拌转速按搅拌桨叶尖线速度放大。

在该优化的放大工艺条件下，30L发酵罐中a—L一1，2一鼠李糖苷酶和d—L一1，6一鼠李糖苷酶的产量分别为2515U／m L和3612U／m L，达到5L发酵罐的水平。

关键词：黑曲霉；仅一L一鼠李糖苷酶；发酵放大：搅拌桨A m pl i f i c at i on of t he f e r m ent at i on pr oces s f or a-L-r ham nos i das e———_f r0I T I5L t o30L f er m ent erZ H A N G X ue-m i n91，M A Jun2，W E I C hun3，Y I N G X i a ng—xi an3，W A N G Z ha03 (1．Z hej i ang t i t an des i gn&ene i nee r i ng C o．，Lt d．，H a ngzhou310012，C hi na；2．Zhej i angH i sun Phar m ace ut i cal C o．，Lt d．，Tai zhou318000，C hi na；3．C ol l ege of B i ol ogi cal a ndE nvi r onm ent al Engi neer ing，Zhej i ang U ni vers i t y of T ec hnol ogy，H angzhou310014，C hi na)A bst r a ct：To pr oduc e a—L—r ham nosi das e(O／一L一1，2一r ham nosi das e and O／一L一1，6一r ham nos i dase) A sper gi U us ni ger W Z001w as us e d t o i nves t i gat e t he am pl i f i cat i on t e chnol ogy o n aer at i on r a t e and agi t at i on s peed f r om5L t o30L f er m ent er．A er a t i on r at e w as am pl i f i ed by t hr ee ki nds of st anda r ds and agi t at i on s peed w as am pl i f i ed by t w o ki nds of st anda r ds．B y t he e xper i m ent s ver i f i cati on，w e ob_ t ai ned t he bes t am pl i f i cat i on cr i t er i a：aer at i on r a t e w as am pl i f i ed w i t h1．5t i m es t he appa r ent l i near s peed and agi t at i on s peed w as am pl i f i ed w i t h bl a de t i p s pe ed．U nder t he opt i m i z ed condi t i ons of am。

鼠李糖脂发酵工艺及结构性质研究的开题报告题目：鼠李糖脂发酵工艺及结构性质研究摘要：鼠李糖脂是一种重要的二甘酰基甘露糖脂，具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤等功能。

本研究旨在探究鼠李糖脂的发酵工艺优化，进而研究其结构性质，为其开发利用提供理论依据。

研究将结合优化发酵工艺条件和传统化学方法，对产物进行纯化和结构鉴定，探讨其生物活性及在食品、保健品等领域的应用前景。

本研究将为鼠李糖脂的进一步应用和开发提供重要的理论参考。

关键词：鼠李糖脂，发酵工艺，生物活性，结构性质，应用前景1.研究背景及意义：鼠李糖脂（SMG）是一类由鼠李果（Sorbus amabilis）种子中提取的二甘酰基甘露糖脂，具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，有望应用于药物、食品、化妆品等领域。

SMG的生物合成及其结构性质研究一直是SMG领域的研究热点，但由于其生产成本较高，制约了其大规模应用。

目前研究表明，SMG可以通过微生物发酵来获得、降低生产成本。

但在微生物发酵过程中，酵母菌在不同条件下生长和代谢过程中，还需要探究更多的优化工艺条件。

同时，结构性质的研究也是近几年来研究的另一重点，这对推动SMG的产业化、进一步利用和发展具有重要意义。

因此，本研究旨在利用发酵技术和结构分析方法，研究SMG的发酵工艺及结构性质，为其进一步的应用和开发提供重要的理论基础。

2.研究方法：2.1 发酵工艺优化选用高产酵母菌进行发酵，以酵母菌种植密度、温度、pH值、转速等因素为影响因素，利用响应面法进行发酵工艺的优化实验，探讨最适合 SMG 生产的发酵工艺条件。

2.2 SMG 结构鉴定采用传统的色谱分离技术对SMG进行纯化，并利用质谱结合核磁共振等先进结构分析技术对SMG的结构进行研究。

3.预期结果：通过发酵工艺优化和SMG结构分析，预期得到以下结果：3.1 最适合鼠李糖脂生产的发酵工艺条件。

3.2 SMG的结构信息，包括其核糖苷酰化位置和立体构型等。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(６):１４２７￣１４３６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ林㊀静ꎬ罗㊀莲ꎬ杨㊀爽ꎬ等.产柚苷酶菌株改良㊁性质及其在柑橘酒中的应用研究进展[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(６):１４２７￣１４３６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０６.０１９产柚苷酶菌株改良㊁性质及其在柑橘酒中的应用研究进展林㊀静ꎬ㊀罗㊀莲ꎬ㊀杨㊀爽ꎬ㊀李㊀萍ꎬ㊀张志清ꎬ㊀陈安均ꎬ㊀刘兴艳(四川农业大学食品学院ꎬ四川雅安６１１１３０)收稿日期:２０２２￣１０￣１０作者简介:林㊀静(１９９７－)ꎬ女ꎬ四川巴中人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物与发酵ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１２９４６８４２９０＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:刘兴艳ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｘｙ０５＠１２６.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀柚苷酶是由α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶及β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶组成的复合酶ꎬ不同来源的柚苷酶在酶学性质和结构特性上有一定的差异ꎬ目前柚苷酶的主要来源是真菌ꎬ真菌来源的柚苷酶最适温度为５０~６０ħꎬ最适ｐＨ值范围为４.０~６ ０ꎬ但柚苷酶的整体结构㊁两种单组分酶的比例构成ꎬ至今尚无详尽的报道ꎮ柚苷酶作用于柑橘酒时ꎬ不仅能脱苦ꎬ还能提高柑橘酒的香气ꎬ其在提高柑橘酒的品质方面具有潜在的应用价值ꎮ本文对柚苷酶的酶学特性㊁结构特性㊁柑橘酒中的苦味物质及柚苷酶在柑橘酒中的应用等进行了综述ꎬ以期为柚苷酶的进一步研究和应用提供理论支持ꎮ关键词:㊀柚苷酶ꎻ酶学性质ꎻ柑橘酒ꎻ柚皮苷ꎻ脱苦ꎻ增香中图分类号:㊀ＴＳ２５５.４６㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０６￣１４２７￣１０ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｓｔｒａｉｎｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅＬＩＮＪｉｎｇꎬ㊀ＬＵＯＬｉａｎꎬ㊀ＹＡＮＧＳｈｕａｎｇꎬ㊀ＬＩＰｉｎｇꎬ㊀ＺＨＡＮＧＺｈｉ￣ｑｉｎｇꎬ㊀ＣＨＥＮＡｎ￣ｊｕｎꎬ㊀ＬＩＵＸｉｎｇ￣ｙａｎ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅꎬＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａａｎ６１１１３０ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｉｓａｃｏｍｐｌｅｘｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆα￣Ｌ￣ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅａｎｄβ￣Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ.Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｏｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓ.Ａｔｐｒｅｓｅｎｔꎬｔｈｅｍａｉｎｓｏｕｒｃｅｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｉｓｆｕｎｇｉ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒａｎｇｅｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｆｒｏｍｆｕｎｇｉｉｓ５０－６０ħ.ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｐＨｒａｎｇｅｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｆｒｏｍｆｕｎｇｉｉｓ４.０－６.０.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｗｏｓｉｎｇｌｅ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｅｎ￣ｚｙｍｅｓｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｄｅｔａｉｌ.Ｗｈｅｎｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｉｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅꎬｉｔｃａｎｎｏｔｏｎｌｙｒｅｍｏｖｅｂｉｔｔｅｒｎｅｓｓꎬｂｕｔａｌｓｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅａｒｏｍａｏｆｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅ.Ｉｔｈａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅꎬｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎａ￣ｒｉｎｇｉｎａｓｅꎬｔｈｅｂｉｔｔｅｒｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｉｎｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅꎻｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎻｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅꎻｎａｒｉｎｇｉｎꎻｄｅｂｉｔｔｅｒｉｎｇꎻｆｌａｖｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ㊀㊀柚苷酶是由α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶(α￣Ｌ￣ｒｈａｍｎｏｓｉ￣ｄａｓｅꎬＥＣ.３.２.１.４０)和β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶(β￣Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｉ￣ｄａｓｅꎬＥＣ.３.２.１.２１)组成的复合酶[１￣２]ꎮ柚苷酶是一种非常重要的工业酶ꎬ在柑橘酒的加工去苦㊁增强果酒香气等方面具有重要的应用价值[３￣４]ꎮ目前国内外已有许多关于柚苷酶的研究ꎬ但主要集中在菌株筛选[５￣６]㊁发酵条件优化[７￣８]及酶的分离纯化[９￣１１]等方面ꎬ对其酶学特性和结构特性的深入研究较少ꎮ目前已有大量产柚苷酶的微生物被筛选出来ꎬ但在７２４１实际应用时ꎬ柚苷酶活力低下㊁生产成本高的问题仍然没有得到解决ꎮ柚苷酶来源广泛ꎬ不同来源的柚苷酶在酶学特性和分子结构方面存在一定的差异ꎬ对柚苷酶的酶学特性和结构特性进行分析将有助于阐明它们的催化反应和底物识别机制ꎬ挖掘其潜在应用价值ꎮ柑橘酒是以柑橘为主要原材料ꎬ经酒精发酵㊁脱苦㊁陈酿㊁澄清等工艺制成的低度果酒[１２]ꎮ当前中国柑橘酒工业化生产还很少见ꎬ这是因为柑橘酒加工过程中会产生强烈的苦味[１３]ꎬ对产品的口感造成很大的影响ꎮ研究结果表明柑橘酒的苦味主要是由柚皮苷和柠檬苦素等物质造成[１４]ꎮ其中ꎬ柚皮苷不仅是典型的黄酮类苦味物质ꎬ还为柑橘酒提供了色素㊁风味物质㊁抗氧化剂ꎬ其含量高低会对酒的色泽㊁口感㊁稳定性㊁生物活性等产生重要的影响[１５]ꎬ因此ꎬ它是一种不可忽略的苦味成分ꎮ柚苷酶能有效降低柚皮苷的含量ꎬ将其转化为无苦味的柚皮素ꎬ使柑橘酒苦味降低ꎬ保持其稳定性和感官特性ꎮ分子末端含有α￣鼠李糖苷和β￣葡萄糖苷的天然糖苷ꎬ均可作为柚苷酶的底物ꎮ因此ꎬ柚苷酶在食品工业中具有极其重要的作用ꎮ目前国内外都有商业化的柚苷酶上市ꎬ商业化的柚苷酶一般来源于黑曲霉和青霉菌ꎬ但由菌株发酵得到的柚苷酶分离纯化困难ꎬ纯化成本高ꎬ且发酵产物还含有其他水解酶ꎬ易产生副产物ꎬ这都不利于柚苷酶的纯化ꎮ本文将分别对柚苷酶的来源㊁酶学特性㊁结构特性㊁柑橘酒中苦味物质及柚苷酶在柑橘酒中的应用进行介绍ꎬ以期为柚苷酶的高值化利用提供理论支持ꎮ１㊀柚苷酶菌株筛选及菌株改良技术研究１.１㊀柚苷酶柚苷酶最早从芹菜种子中分离出来ꎬ后在柚子叶中也发现了柚苷酶ꎬ随着研究深入ꎬ陆续从许多植物㊁动物和某些微生物中分离获得了柚苷酶[１６￣１８]ꎮ然而ꎬ由于生产成本及环境因素的限制ꎬ现在市面上的柚苷酶产品几乎都来自于微生物ꎬ微生物来源的柚苷酶大多是胞外酶ꎬ且需要在培养基中添加诱导物如柚皮苷来诱导菌株产酶[１９]ꎬ诱导物价格昂贵ꎬ这在一定程度上增加了柚苷酶的生产成本ꎮ已有研究结果表明ꎬ产柚苷酶的微生物菌株主要有两种ꎬ一种是曲霉ꎬ另一种是青霉ꎮ然而ꎬ由于黑曲霉菌的培养技术和在食品工业生产中的应用技术更加成熟ꎬ同时还由于其次生代谢产物的安全性相对较高ꎬ因此更适合食品工业生产的大规模应用ꎮ１.２㊀柚苷酶菌株筛选方法柚苷酶菌种可从自然环境中直接筛选得到ꎮ筛选产柚苷酶菌株常用到的方法有半固态试管法㊁定性滤纸显色法㊁透明圈法等[２０￣２１]ꎮ在菌株筛选的早期研究中ꎬ主要采用半固态试管法ꎬ菌株在试管中生长产酶ꎬ柚苷酶将柚皮苷分解形成透明层ꎮ随着培养时间的增加ꎬ柚苷酶在培养基中扩散ꎬ透明层逐渐变大ꎬ透明层的大小可判断菌株产酶能力的大小ꎮ该方法可初步获得产柚苷酶能力较强的菌株ꎮ但由于柚皮苷溶解度低ꎬ会影响对透明层的观察ꎬ从而降低实验结果的准确性ꎮ定性滤纸显色法是利用菌株产生的柚苷酶消耗掉柚皮苷后与柚皮苷显色液发生颜色反应而筛选菌株的方法ꎮ该筛选方法操作简单ꎬ但由于定性滤纸表面呈现的颜色不能作为确定该菌株产酶能力的定量依据ꎬ因此需要对产酶菌株进一步筛选ꎮ透明圈法是一种快速初步筛选菌株的方法ꎬ利用透明圈法筛选菌株时ꎬ在固体培养基中混入一些溶解性差的营养成分ꎬ使培养基浑浊㊁不透明ꎮ如果培养基上生长了目的菌株ꎬ就会利用这种营养成分ꎬ在菌落周围产生透明圈ꎮ有学者发现ꎬ与半固态试管法形成的透明层相比ꎬ透明圈法形成的透明圈不仅更容易观察ꎬ且可根据透明圈大小判断菌株产酶能力的强弱[２２]ꎬ实验操作简单ꎬ透明圈法是目前筛选产柚苷酶菌株常用方法ꎮ１.３㊀柚苷酶菌株改良技术柚苷酶来源广泛ꎬ但自然筛选得到的菌株产生柚苷酶活力较低ꎬ需要对菌株进行改良以提高产酶活力ꎬ目前改良产柚苷酶菌株常用到的技术有物理诱变㊁化学诱变[２３]及基因重组技术[２４]等ꎮ１.３.１㊀物理诱变㊀物理诱变是目前常用的菌株改良技术之一ꎬ即使用紫外线㊁Ｘ射线㊁中子㊁微波㊁超声波等诱变源对菌株进行诱变ꎬ使菌株发生突变的技术ꎮ物理诱变所用到的设备简单㊁操作方便ꎬ利用诱变源进行诱变ꎬ可得到大量的高产菌株ꎬ在微生物的诱变育种中发挥了极其重要的作用[２５]ꎮ袁文博等[２６]利用常温室压等离子体技术对１株产柚苷酶菌株互隔交链孢霉(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔｅ)ＳＫ.３７００１进行诱变ꎬ获得了１株高产柚苷酶菌株(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌ￣８２４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第６期ｔｅｒｎａｔｅ)ＳＫ.３７００２ꎬ产酶活力比原始菌株提高了２０８％ꎮ黄超等[２７]从腐烂柚皮中筛选到１株黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ)ꎬ并对其进行紫外诱变ꎬ选育得到了１株酶活力达９３３ ３Ｕ/ｍｌ的突变菌株ꎬ产酶活力是原始菌株的２ ２５倍ꎮ１.３.２㊀化学诱变㊀化学诱变是指利用碱基类似物㊁脱氨剂㊁烷化剂等化学诱变剂使菌株发生突变的技术ꎬ目前常用的诱变剂有亚硝基胍(ＮＴＧ)㊁乙烯亚胺(ＥＩ)㊁硫酸二乙酯(ＤＥＳ)㊁叠氮化钠(ＮａＮ３)等ꎮ化学诱变只需少量的药剂和简单的设备ꎬ具有经济方便㊁快速高效的优点[２５]ꎮ陈玲等[２８]采用ＮＴＧ对出发菌株孢子进行诱变ꎬ得到１株突变菌株３￣５４￣ＮＴＧ￣１６ꎬ测定其酶活力达７７０ ０６Ｕ/ｍｌꎬ比出发菌株提高了近１００％ꎮ但在使用化学诱变剂时ꎬ一些化学诱变剂如ＮＴＧ㊁ＤＥＳ等对人体健康有一定的危害ꎬ操作时应做好防护ꎬ减少与诱变剂接触ꎮ１.３.３㊀基因重组技术㊀基因重组技术是将生物体内控制特定性状的基因作为外源基因ꎬ按照人为意愿定向改变生物遗传形状的技术ꎬ外源基因经体外重组后可转入到受体体内并复制㊁转录㊁翻译㊁表达ꎬ从而使受体获得供体特定的性状与功能[２９]ꎮ利用基因重组技术ꎬ寻找合适的微生物来源的柚苷酶基因以及合适的表达载体ꎬ从而使柚苷酶高效表达ꎬ对提高柚苷酶的酶活力及其应用具有重要意义ꎮ现已有关于柚苷酶中的α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶通过酵母细胞克隆和表达的相关报道[３０￣３２]ꎬ但由于柚苷酶是一种复合酶ꎬ并不是单一的酶系ꎬ所以使得产柚苷酶微生物的基因工程育种难度较大ꎬ因此在构建产柚苷酶的基因工程菌时需对两种酶的结构性质及相互关系进行进一步的深入研究ꎮ１.３.４㊀复合诱变㊀复合诱变是指用两种或两种以上的诱变剂对生物体进行处理ꎬ从而获得突变体的方法ꎬ包括两种或多种诱变剂先后使用㊁同一种诱变剂的重复作用㊁两种或多种诱变剂的同时使用ꎮ复合诱变具有协同效应ꎬ比单一诱变效果好ꎮ朱运平等[２３]采用紫外线￣亚硝酸钠复合诱变ꎬ选育出１株突变菌株ＵＮ２ꎬ该菌株产柚苷酶活力达１４７Ｕ/ｍｌꎬ且具有较好的稳定性ꎮＸｉａ等[３３]对从发霉的柚皮中分离出的柚皮苷酶生产菌株(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ)ＭＮ５８９８４０进行紫外与常压室温等离子体复合诱变ꎬ筛选出１株ＵＡ１３突变体ꎬ酶活力２４７５.１６Ｕ/ｍｇꎬ产柚苷酶活力提高了２０６％ꎮ这些结果表明复合诱变是筛选高产柚皮苷酶菌株的有效策略ꎮ２㊀柚苷酶的性质２.１㊀柚苷酶的酶学性质酶的适宜温度范围㊁ｐＨ值和热稳定性是实现工业化生产必需考虑的因素ꎬ也是限制很多酶工业化生产的重要因素ꎮ反应体系的温度和ｐＨꎬ不仅会影响底物和产物的溶解性和稳定性ꎬ而且决定着整个生产流程和对设备的要求ꎬ而酶的热稳定性也与酶的利用率㊁原料损耗和生产成本等息息相关[３４]ꎮ不同来源的柚苷酶ꎬ甚至相同来源不同类型的柚苷酶在酶学性质上都存在一定差异ꎬ表１总结了部分不同来源的柚苷酶及其酶学性质ꎬ从表中可以看出ꎬ不同来源柚苷酶在分子质量㊁最适温度和最适ｐＨ值等方面都各不相同ꎬ但总体上其最适温度为５０~６０ħꎬ最适ｐＨ值为４.０~６ ０ꎮ柚苷酶具有α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶和β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶两种酶的活性ꎬ在柚苷酶的作用底物上ꎬ多数柚苷酶都能够同时水解多种糖苷键ꎮα￣Ｌ￣鼠李糖苷酶作为柚苷酶中重要组成成分之一ꎬ可以特异性地水解聚糖或者糖苷类化合物末端的α￣１ꎬ２㊁α￣１ꎬ３㊁α￣１ꎬ４㊁α￣１ꎬ６糖苷键ꎬ释放Ｌ￣鼠李糖[３５]ꎮ柑橘汁和柑橘酒中的柚皮苷能被α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶水解ꎬ生成苦味稍弱的普鲁宁和鼠李糖ꎬ而柚苷酶中的β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶则进一步水解普鲁宁ꎬ生成无苦味的柚皮素和葡萄糖ꎮ柚苷酶水解柚皮苷的流程如图１所示ꎬ除柚皮苷外ꎬ分子末端含有α￣鼠李糖苷和β￣葡萄糖苷的天然糖苷ꎬ如芸香柚皮苷㊁橙皮苷㊁芦丁等ꎬ均可作为柚苷酶的底物[４ꎬ３６]ꎮ２.２㊀柚苷酶的结构特性柚苷酶的天然来源广泛ꎬ它们的功能相似但是结构多变ꎮ对柚苷酶的功能域分析有助于对其催化机制与底物识别的理解ꎬ关于柚苷酶的结构研究ꎬ至今尚无详尽报道ꎮ国内外学者对柚苷酶进行研究分析发现其表现为单一的糖蛋白[３７￣３８]ꎬ这表明柚苷酶结构具有单体的特点ꎬ柚苷酶单体结构上具有两个催化位点ꎬ一个位点用于α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶的催化ꎬ另一个位点用于β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的催化[４０]ꎮ目前已有研究结果表明ꎬ酪氨酸作为一种重要的残基在α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶及β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的作用过程中参与催化[４０]ꎬ这似乎也证实柚苷酶是一种单体酶ꎮ但是ꎬ目前在青霉和曲霉的基因组上还没有找到能同时编码α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶与β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶基９２４１林㊀静等:产柚苷酶菌株改良㊁性质及其在柑橘酒中的应用研究进展因[４１￣４３]ꎮ相反ꎬ关于编码这两种酶的独立基因却被多次报道[４４￣４５]ꎬ同时这两种酶也被很多学者单独分离纯化[３９ꎬ４６￣４８]ꎬ这些结果暗示了柚苷酶有可能是由两种酶组成的复合酶ꎬ而不是具有两个酶活性位点的单链结合蛋白质ꎮ表１㊀不同来源的柚苷酶及其酶学性质Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ来源㊀㊀㊀㊀㊀相对分子质量(ˑ１０３)最适温度(ħ)最适ｐＨ值酶活力(Ｕ/ｇ)ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖａｎＴｉｅｇｈｅｍＭＴＣＣ２４２５[４９]１０~８０５０５.０５４６０.００Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｉｄｕｓ[５０]５０６０５.０３６.００ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＴＣ￣０１[５１]－６０４.０６４２９.３０ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＦＦＣＣ８４８[５２]６５.１２５０４.５６９３２.５４Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.１５２３[５３]８９.０２/７２.０２５０４.０４４７８.７６Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ[５４]７０－６.０－ＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉＤＳＭ２０２８４[５４]７４６０５.５１２００.００图１㊀柚苷酶水解柚皮苷的过程Ｆｉｇ.１㊀Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｎａｒｉｎｇｉｎｂｙｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅ㊀㊀虽然目前尚不知道柚苷酶的整体结构ꎬ但是许多学者对柚苷酶的两种组成成分α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶和β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的单独结构进行了研究ꎬ从ＣＡＺｙ数据库可知ꎬα￣Ｌ￣鼠李糖苷酶可来自ＧＨ７８家族㊁ＧＨ２８家族㊁ＧＨ１０６家族ꎮ随着研究的深入ꎬ不同来源的α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶的晶体结构已被解析(表２)ꎬＣｕｉ等[５５]对来自芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＧＬ１菌株的柚苷酶进行结晶ꎬ确定了其α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶有５个结构域ꎬ其中４个是β￣三明治夹心结构ꎬＣｕｉ指定为结构域Ｎ㊁Ｄ１㊁Ｄ２和Ｃꎻ另一个是(α/α)６￣桶状结构ꎬＣｕｉ指定为结构域Ａꎬ其三维结构如图２所示ꎬ还发现α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶中的(α/α)６￣桶状结构提供了一个可容纳鼠李糖基的裂缝ꎬ带负电的氨基酸残基如Ａｓｐ５６７㊁Ｇｌｕ５７２㊁Ａｓｐ５７９㊁Ｇｌｕ８４１等在这个裂缝里可直接与鼠李糖接触发生作用ꎬ表明这些残基是酶催化的活性位点ꎮＦｕｊｉｍｏｔｏ等[５６]对ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓＲｈａ(ＳａＲｈａ７８Ａ)及Ｒｈａ与Ｌ￣鼠李糖结合后的晶体结构进行了研究ꎬ发现其有６个结构域:Ｎ㊁Ｄ㊁Ｅ㊁Ｆ㊁Ａ和Ｃꎬ同时发现Ｇｌｕ６３６㊁Ｇｌｕ８９５在酶催化过程中具有关键作用ꎬ这一结论也与Ｃｕｉ等[５５]的研究结果类似ꎮ从表２也可以看出ꎬ不同来源的α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶的晶体结构有所差异ꎬ但其结构中都含有催化结构域及β￣夹层结构域ꎮ０３４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第６期表２㊀不同来源的α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶的结构Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆα￣Ｌ￣ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓα￣Ｌ￣鼠李糖苷酶来源菌株㊀㊀α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶结构㊀㊀㊀参考文献Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＧＬ１α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶有５个结构域ꎬ其中４个是β￣三明治夹心结构ꎬ另一个是(α/α)６￣桶状结构ꎬ(α/α)６￣桶状结构提供１个可容纳鼠李糖基的裂缝ꎬ裂缝里一些带负电的氨基酸残基为催化活性位点ꎮ[５５]Ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓα￣Ｌ￣鼠李糖苷酶与Ｌ￣鼠李糖结合后的晶体结构有６个结构域:Ｎ㊁Ｄ㊁Ｅ㊁Ｆ㊁Ａ和Ｃꎬ一些氨基酸残基(如:Ｇｌｕ６３６㊁Ｇｌｕ８９５)在酶催化过程中具有关键性作用ꎮ[５６]ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓＪＭＵｄｂ０５８由Ｎ端结构域㊁Ｃ端结构域㊁２个β￣折叠结构域及(α/α)６￣桶状催化结构域Ａ构成ꎮ[５７]Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ由螺旋结构的催化结构域Ａ及β￣夹层结构的二聚结构域Ｂ构成ꎮ[５８]图２㊀α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶的三维结构图[５５]Ｆｉｇ.２㊀Ｔｈｒｅｅ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅα￣Ｌ￣ｒｈａｍｎｏｓｉ￣ｄａｓｅ[５５]㊀㊀有学者对β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的结构进行了研究[５９￣６０]ꎬ不同来源的β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的结构有所差异(表３)ꎬＰｏｚｚｏ等[６１]对ＧＨ３家族的β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的结晶构造(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:２Ｘ４０￣Ａ)进行了报道ꎬ它由(α/β)８￣结构域和三明治结构域[６条(α/β)链]及Ｃ端纤连蛋白Ⅲ型结构域组成ꎮ孙月龙[５７]对棘孢曲霉产生的β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的三维结构(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＢＧＬ１￣ＡＳＰＡＣ)进行了模拟ꎬ其三维结构模拟图如图３示ꎮ该酶由１个(α/β)８￣结构域和１个具有５条(α/β)链的三明治结构域组成ꎬ其Ｃ端没有纤连蛋白Ⅲ型结构域ꎬ呈不规则的卷曲状ꎮ通过比对发现该酶的活性位点是位于２个结构域表面相距较远的Ａｓｐ２８０与Ｇｌｕ５０９ꎮＭｏｈｓｉｎ等[６２]对β￣葡萄糖苷酶的结构进行研究ꎬ结果与前面两位学者的类似ꎮ对于柚苷酶的结构ꎬ虽然目前已有学者对其单组分的结构进行了研究ꎬ但柚苷酶的整体结构㊁柚苷酶两种组成成分的比例构成ꎬ目前尚无详尽的报道ꎮ表３㊀不同来源的β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的结构Ｔａｂｌｅ３㊀Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆβ￣Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓβ￣Ｄ￣葡萄糖苷酶来源菌株β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶结构参考文献Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由(α/β)８￣结构域和三明治结构域[６条(α/β)链]及Ｃ端纤连蛋白Ⅲ型结构域组成ꎮ[６１]ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓＪＭＵｄｂ０５８由１个(α/β)８￣结构域和１个具有５条(α/β)链的三明治结构域组成ꎬ其Ｃ端没有纤连蛋白Ⅲ型结构域ꎬ呈不规则的卷曲状ꎮ[５７]Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由３个不同的结构域组成:催化磷酸三糖异构酶(ＴＩＭ)桶状结构域ꎬα/β￣三明治结构域和纤连蛋白Ⅲ型结构域ꎮ[６２]３㊀柚苷酶在柑橘酒酿造中的应用３.１㊀柑橘酒的脱苦３.１.１㊀柑橘酒中的苦味物质㊀了解柑橘中的苦味物质及其降解机理ꎬ有针对性地去除其中的苦味成分对提高柑橘产品的品质至关重要ꎮ柑橘酒中的苦味主要来源于以下三个方面:(１)柑橘原料中所含的黄酮类及其衍生物质ꎬ如芸香柚皮苷㊁柚皮苷㊁新橙皮苷等ꎻ(２)发酵过程中无苦味物质转变成苦味物质ꎬ也就是在榨汁和酿制时产生的 延迟苦味 ꎬ如柠檬苦素㊁诺米林等ꎻ(３)柑橘酒发酵过程中ꎬ由于残糖㊁氨基酸和维生素等营养物质的存在ꎬ使得乳酸菌㊁产苦味杂菌等生长产生的苦味[１４￣１５]ꎮ表４㊁表５总结了柑橘果实及柑橘酒中的主要苦味物质ꎬ从１３４１林㊀静等:产柚苷酶菌株改良㊁性质及其在柑橘酒中的应用研究进展表中可以看出柑橘酒中柚皮苷的含量远高于柠檬苦素和诺米林ꎬ是柑橘酒中主要的苦味物质ꎮ柚苷酶的作用底物柚皮苷㊁芸香柚皮苷等是存在于柑橘类水果原料中的主要苦味物质ꎬ品种㊁采样地点㊁成熟期及栽培环境不同的柑橘ꎬ其苦味成分的组成和含量也会不同ꎮ因此在柑橘酒酿造过程中ꎬ原料的选择至关重要ꎬ柑橘类水果原料中含有大量的苦味代谢物ꎮ柑橘果肉中的柚皮苷在幼果期和果实膨胀期含量较多ꎬ到成熟阶段含量则逐步下降[６３]ꎬ从表４可以看出柑橘果实中的苦味物质主要集中在囊衣㊁果皮和种子中[６４]ꎬ因此在进行柑橘酒酿造时ꎬ应选择充分成熟的柑橘原料ꎬ并在榨汁时彻底去除果皮和种子ꎬ降低柑橘酒中苦味物质含量ꎮ图３㊀β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的三维结构图[６０]Ｆｉｇ.３㊀Ｔｈｒｅｅ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆβ￣Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ[６０]表４㊀柑橘果实中主要的苦味物质含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｍａｉｎｂｉｔｔｅｒｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎｃｉｔｒｕｓｆｒｕｉｔｓ种类㊀㊀㊀㊀部位㊀㊀㊀黄酮类物质柚皮苷柠檬苦素类物质柠檬苦素诺米林金诺果[６５]果汁(ｍｇ/ｍｌ)０.２３００.２１８果皮(ｍｇ/ｇ)０.４２２４.６９０－种子(ｍｇ/ｇ)０.１３４９.５２０沙田柚[６６]果汁(ｍｇ/ｍｌ)０.２０００.００２０.００４果皮(ｍｇ/ｇ)５.２９００.８４６０.６５２种子(ｍｇ/ｇ)０.３７０１.１９０１.５７５囊衣(ｍｇ/ｇ)４.９１００.０２３０.０５２表５㊀柑橘饮料中主要的苦味物质含量Ｔａｂｌｅ５㊀Ｍａｉｎｂｉｔｔｅｒｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎｃｉｔｒｕｓｗｉｎｅ种类㊀㊀黄酮类物质柚皮苷(ｍｇ/Ｌ)总黄酮(ｍｇ/ｋｇ)柠檬苦素类物质柠檬苦素(ｍｇ/Ｌ)诺米林(ｍｇ/Ｌ)脐橙汁[６７]－４.４３００.０７０碰柑酒[６８]５６６.３００１０.８７０２.２００椪柑酒[６９]－１２.８７８１０.０２３脐橙酒[６７]－０.０５００.０８０柚子酒[７０]１６５.６９０１７.０８０－蜜柚果酒[７１]０.１４４０.０４８－３.１.２㊀柚苷酶对柑橘酒的脱苦应用研究㊀在柑橘汁和柑橘酒的生产中ꎬ苦味对果酒的风味及品质有一定的影响ꎬ其中以柚皮苷为主要苦味成分[７２￣７３]ꎮ研究结果表明ꎬ在柑橘汁中ꎬ柚皮苷含量大于１ ５ｍｇ/ｍｌ会对果汁的品质产生一定的影响[７４]ꎮ采用柚苷酶水解法ꎬ不仅可以有效降低柚皮苷含量ꎬ而且可以保持柑橘类产品原有的风味和营养ꎬ增加消费者的接受程度ꎬ是一项非常有前景的技术ꎮ柚苷酶水解法具有专一性强㊁操作简单㊁不损失风味和营养等优点ꎬ是当前最理想的脱苦方式ꎮ江飞凤等[７０]采用柚苷酶对柚子酒进行脱苦ꎬ发现酶添加量２ ０ｇ/Ｌ㊁反应温度５０ħ㊁反应时间６０ｍｉｎ㊁ｐＨ４ ０时ꎬ柚子酒２３４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第６期脱苦率为５３ ６７％ꎮ张方艳等[７５]采用柚苷酶对柑橘酒进行脱苦ꎬ发现对发酵后的柑橘酒进行加酶处理的脱苦效果比发酵前对鲜榨柑橘汁进行加酶处理的脱苦效果更好ꎬ且当柑橘酒中柚苷酶添加量为６ｇ/Ｌ㊁ｐＨ７ ０㊁反应温度５０ħ㊁反应时间６０ｍｉｎ时ꎬ脱苦效果最好ꎬ柑橘酒脱苦率可达到６４ ０５％ꎮ目前国内外已有柚苷酶上市ꎬ但其在食品工业中并没有广泛应用ꎬ主要原因是缺乏高产柚苷酶的菌株ꎬ且柚苷酶的酶活性低ꎬ柑橘汁和柑橘酒中的低ｐＨ值环境也会抑制柚苷酶的活性ꎮ除此之外ꎬ目前对柚苷酶在柑橘酒中的脱苦研究还较少ꎬ大多集中在对柑橘汁的脱苦研究上ꎬ虽已有学者对发酵前脱苦和发酵后脱苦的柑橘酒进行研究[７６]ꎬ但是缺乏与原酒的对比ꎮ在用柚苷酶进行脱苦时ꎬ柚苷酶分离纯化成本大ꎬ目前的试验大多是向柑橘汁和柑橘酒中直接加入发酵粗酶液进行脱苦ꎬ这虽然能在一定程度上降低柑橘汁和柑橘酒中的苦味物质ꎬ但发酵液中的其他物质及灭酶活时的高温环境对柑橘汁和柑橘酒的品质也存在一定的不良影响ꎬ后续可针对这些问题进行研究ꎬ提高柑橘酒的品质ꎮ３.２　柑橘酒的增香果酒酿造过程中的某些单萜类物质对果酒的风味有重大贡献ꎬ这些化合物以游离形式如芳樟醇㊁橙花醇㊁香叶醇㊁α￣松油醇㊁香茅醇㊁氧化芳樟醇或者与糖基结合的香气前体形式存在[７７]ꎮ这些香气前体物质多为无味ꎬ以β￣Ｄ￣吡喃糖苷和二苷的形式存在ꎬ如６￣Ｏ￣α￣Ｌ￣呋喃糖苷￣β￣Ｄ￣吡喃糖苷㊁６￣Ｏ￣α￣Ｌ￣鼠李糖基￣β￣Ｄ￣吡喃糖苷(芦丁苷)和６￣Ｏ￣β￣Ｄ￣吡喃糖苷￣β￣Ｄ￣吡喃糖苷等[７１]ꎬ酸解或酶解时可释放出游离态香气物质ꎬ从而影响果酒风味ꎮ与酸解法相比ꎬ酶解法对果酒中的单萜类成分影响较小ꎬ因而更具优势ꎮβ￣Ｄ￣葡萄糖苷酶水解糖苷键配体中芳香成分和糖基间的糖苷键后ꎬ能有效实现增香ꎮ但当糖苷与双糖相连时ꎬ则需要先被酶如β￣木糖苷酶㊁α￣阿拉伯糖苷酶或α￣Ｌ￣鼠李糖苷酶等水解分子末端的双糖后ꎬβ￣Ｄ￣糖苷酶才能水解释放糖苷配体[３ꎬ７８]ꎬ其水解释放糖苷配体过程如图４所示ꎮ因为香气和苦味物质作为影响柑橘酒品质和风味的两个重要指标ꎬ所以β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶在提升柑橘酒香气和脱苦方面的应用备受关注[３]ꎮ柚苷酶中含有β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶ꎬ柚苷酶作用于柑橘酒时ꎬ不仅能脱苦ꎬ同时还能提高柑橘酒的香气ꎮ有学者对未经脱苦处理的柚子酒和脱苦后的柚子酒香气成分进行分析发现ꎬ脱苦处理后生成了３种新成分ꎬ分别是顺￣９￣十六碳烯酸乙酯㊁正丙醇和正己酸乙酯ꎬ这３种香气成分之间可以互相协同ꎬ提升柚子酒风味[７０]ꎮβ￣Ｄ￣葡萄糖苷酶能有效提高柑橘酒风味ꎬ然而目前葡萄糖苷酶主要应用于葡萄酒和蓝莓酒上ꎬ在柑橘酒上的研究和应用还比较少ꎬ且柑橘酒在加工过程中的很多因素都会影响β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶的活性ꎬ从而影响产品风味ꎬ后续应进一步对β￣Ｄ￣葡萄糖苷酶在柑橘酒中的应用进行深入研究ꎮ４㊀总结及展望综上所述ꎬ柚苷酶是非常重要的工业酶ꎬ其在柑橘酒的脱苦及增香方面具有潜在的应用价值ꎮ近年来对柚苷酶的研究主要集中在产柚苷酶菌株的筛选ꎬ柚苷酶酶学性质及其在柑橘汁㊁柑橘酒脱苦应用等方面ꎬ但其结构㊁功能及分子生物学方面还没有被深入研究ꎬ现有研究对柚苷酶作用的分子机制也知之甚少ꎬ其晶体结构尚未确定ꎮ除此之外ꎬ柚苷酶目前在柑橘酒中的脱苦应用研究较少ꎬ柑橘酒的脱苦效果也不理想ꎬ其产品风味受到了严重影响ꎮ因此ꎬ在不影响柑橘酒本身风味物质的前提下ꎬ酶解法脱苦对有效去除柑橘酒中的苦味㊁提高柑橘酒品质具有重要的意义ꎮ鉴于目前柚苷酶及其应用存在的问题ꎬ未来可以考虑从以下几方面进行研究: (１)产柚苷酶菌一般为诱导性菌株ꎬ需要向培养基中加入诱导物诱导其产酶ꎬ诱导物价格昂贵ꎬ生产成本较高ꎬ这也是柚苷酶不能工业化生产的重要原因ꎬ后续可考虑筛选组成型的产柚苷酶菌株ꎮ(２)目前对柚苷酶的研究主要集中于菌种的筛选㊁发酵工艺优化及简单酶学性质研究ꎬ柚苷酶是由两种酶构成ꎬ其整体结构是单一蛋白还是组合蛋白及两种酶的比例构成尚不清楚ꎬ如果其是单体酶ꎬ则应对其整体结构进行研究ꎬ如果是由两种酶组成ꎬ则应对其单组分结构和组成比例进行研究ꎮ㊀㊀(３)柚苷酶分离纯化成本高ꎬ且其在柑橘酒中的应用研究还较少ꎬ柑橘酒的ｐＨ值偏低ꎬ而柚苷酶的最适ｐＨ值为４~６ꎬ柑橘酒的酸性环境会抑制柚苷酶的活性ꎮ除此之外ꎬ柑橘酒中的其他成分也会抑制柚苷酶的活性ꎬ后续可考虑筛选耐酸性的高产柚苷酶的菌株ꎬ将其与酵母菌混菌发酵ꎬ在发酵的同时去除苦味物质ꎮ３３４１林㊀静等:产柚苷酶菌株改良㊁性质及其在柑橘酒中的应用研究进展。

L—鼠李糖的制备及检测方法研究进展作者：高旭东等来源：《安徽农业科学》2014年第18期摘要L鼠李糖作为一种微量糖广泛分布于植物中，是食品加工中常用的甜味剂之一，还可用于生产香精香料。

研究发现， L鼠李糖还可以诱导酵母甘露聚糖提高在动物机体中α甘露糖苷酶的活性，显示出良好的药用价值。

一方面介绍了L鼠李糖的制备方法及应用的研究情况，另一方面根据L鼠李糖的化学性质及测定原理，结合近年来L鼠李糖含量检测研究领域中的最新研究成果，综述了L鼠李糖的检测方法，并重点从薄层色谱发（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）及二硝基水杨酸法（DNS）等几方面介绍L鼠李糖的定性、定量检测方法，并对各种检测方法的优缺点进行了比较。

关键词L鼠李糖；薄层色谱；高效液相色谱；二硝基水杨酸法中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05966-03甘露糖六位的一个羟基被氢取代而衍生的一种单糖，称为L鼠李糖（Rhamnose），又称鼠李糖、甲基戊糖，L鼠李糖的纯品为无色粉末，呈结晶状，自然界里主要存在于植物多糖、糖苷、植物胶及细菌多糖中，多为L型。

其甜度是蔗糖的33%，可用于生产香精香料，可食用；可以作为药物的中间体、合成强心药物；可与其他物质反应形成风味物质、用作甜味剂；可用于农作物疾病的防治；还可作为肠道渗透测试剂使用，并具有明显的抗癌作用[1-3]。

L鼠李糖可以在植物中提取，也可以用发酵法等途径进行工业生产。

目前，国内外提取、分离和制备L鼠李糖的技术工艺水平日趋提高，笔者就近年来L鼠李糖的制备方法和检测方法等几方面概述L鼠李糖的研究进展。

1 L鼠李糖的制备方法1.1植物中L鼠李糖的提取在自然界中，由于L鼠李糖多存在于植物和细菌中，故可利用植物资源提取L鼠李糖。

肖芳等在穿龙薯蓣皂甙酸解液中提取L鼠李糖所选方法为醇提取联合高压酸解法[4]。

具体操作为：取新鲜穿龙薯蓣100 g，研磨并过筛后离心15 min，加醇提取所得离心沉淀2次，合并提取液，水浴蒸馏，溶剂回收，剩余馏渣即皂甙粗提物；60 ℃干燥至恒重后，于0.14 MPa下将其加适量酸水解一定时间，过滤；滤液添加Ca（OH）2中和至中性或偏酸性，脱色并过滤，添加酵母培养数小时，跟踪测定葡萄糖至耗尽，发酵终止；过滤除去酵母及部分杂质，测定滤液的L鼠李糖含量，计算L鼠李糖得率；滤液浓缩后用乙醇重结晶，得L鼠李糖晶体，最终L鼠李糖得率最高为0.196%。

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase ，EC 3.2.1.40）广泛存在于自然界中，如哺乳动物组织、植物、真菌、细菌等[1-4]。

该酶是一种应用广泛的糖苷水解酶，它能高效水解多种末端含有非还原性鼠李糖残基的天然化合物，如水解芦丁为异槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 为淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷为普鲁宁等[4]。

此外，少数α-L-鼠李糖苷酶还能以L-鼠李糖为供体，通过逆水解反应催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚类化合物鼠李糖基化等[6，7]。

迄今为止，根据CAZy 数据库，α-L-鼠李糖苷酶分属于三大糖苷水解酶家族，即GH13家族、GH78家族和GH106家族[8]，其中大部分属于GH78家族。

此外，α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的酶，在食品和制药工业中有着广泛的应用。

然而，目前报道的α-L-鼠李糖苷酶普遍产量不高，到目前为止，全球还没有商品化的α-L-鼠李糖苷酶产品，这极大限制了该酶在工业上的应用。

大肠杆菌是遗传背景最清楚的菌株，其具有培养成本低、抗污染能力强、生长周期短、蛋白表达量高等优势，已经成为最常用的外源蛋白表达系统。

采用高密度发酵技术，能显著提高所培养的菌体密度，最终增加单位体积单位时间内目的产物的比生产率，缩减生产周期，提升经济效益，已经在工业中有很广泛的应用[9]。

在大肠杆菌高密度发酵中，大多采用补料分批发酵方式，以实现高密度的大肠杆菌和所需的蛋白质生产[10]。

这种补料方式一方面可以避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象，另一方面又能够防止因限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。

重组大肠杆菌高密度发酵是一个复杂的过程，需要对其生长的发酵参数进行优化，如葡萄糖进料速率、诱导温度、诱导pH 等。

葡萄糖是一种便宜且速效碳源，在大肠杆菌发酵生产中优于其他碳源。

但是，在有氧条件下，过多的葡萄糖会导致大肠杆菌代谢副产物的产生。

最常见的副产物是乙酸，它是由磷酸转乙酰酶（PTA ）/乙酸激酶（ACKA ）和丙酮酸氧化酶（POXB ）两种途径产生的[11]，主要原因是加入中央代谢系统的碳与细胞呼吸或三羧酸循环的有限能力之间不平衡[12]。