包裹阿霉素的高分子材料微泡声学造影剂制备及显影效果实验研究

基金项目:国家自然科学基金重点(30430230)及面上(30370402)项目、重庆市重点科技攻关项目(渝科发计字[2002]28号) 作者单位:400010　重庆医科大学附属第二医院超声科(冉海涛、王志刚、郑元义、张群霞、李小东、许川山),重庆医科大学病毒性肝炎研究所(任红)・实验研究・包裹阿霉素的高分子材料微泡声学造影剂制备及显影效果实验研究冉海涛　任　红　王志刚　郑元义　张群霞　李小东　许川山摘　要　目的　探索包裹药物的微泡声学造影剂制备方法,观察其体内外显影效果。

方法　采用在体内能生物降解的人工合成高分子聚合物乳酸/羟基乙酸共聚物(P LG A )作为成膜材料,通过双乳化法和冷冻干燥技术制备包裹阿霉素(ADM )和空气的P LG A 微泡声学造影剂(ADM -P LG A 声学造影剂)。

光学显微镜进行形态学观察。

体外和动物实验观察其显影效果。

结果　采用本法成功制备了ADM -P LG A 声学造影剂;光镜观察其形态规则,呈球型,大小均匀,最大粒径<4μm ;体内外显影效果好。

结论　通过本方法可以合成包裹水溶性药物的微泡声学造影剂,为应用超声波和微泡造影剂进行体内药物定位释放研究打下了基础。

关键词　声学造影剂　药物　包裹　制备R esearch on fabrication of high molecular polymer ultrasound contrast agent for drug deliveryRan Haitao ,Ren H ong ,Wang Zhigang ,et al .The Department of Ultras onography ,the Second A ffiliated H ospital of Chongqing Medical University ,Chongqing 400010,China ABSTRACT Objective T o develop High M olecular P olymer Ultras ound C ontrast Agent for drug delivery ;T o study the effect on ultras ound imaging ,and to quantify drug encapsulation efficiency and drug loading am ounts.Methods P LG A ,a novel artificial and biodegradable high m olecular polymer -poly lactic -co -glycolic acid ,was employed to fabricate the ultras ound contrast agent with Adriamycin (ADM )and air inside by a double emulsion method and ly ophilization method.Light microscope was used to study the shape and surface m orphology of the ADM -P LG A contrast agent.UV -Vis S pectrophotometer was used to quantify drug encapsulation effi 2ciency and drug loading am ounts.Then experiments in vitro and in viv o were employed to study the effects of ADM -P LG A contrast a 2gent on the enhancement of ultras ound imaging.R esults This method could produce uniformly ADM -P LG A ultras ound contrast agent with a tight size distribution and sm ooth surface ,which were determined under the light microscope.It was an effective ultras ound con 2trast agent both in vitro and viv o.The drug loading am ounts was about 5.46%(mg/g ),and drug encapsulation efficiency was 68.25%.Conclusion This method could produce an ultras ound contrast agent for drug delivery.Because of its potential ability of releasing drug to targeted place by using ultras ound ,it must have a bright future in application field.KE Y WOR DS Ultras ound contrast agent Drug Encapsulation Fabrication资料与方法一、包裹药物的微泡声学造影剂制备(一)材料与仪器1.试剂:盐酸阿霉素(ADM ,法玛西亚有限公司)、乳酸/羟基乙酸共聚物(P LG A ,聚合比例为65∶35,Sig 2ma 公司)、聚乙醇酸(PVA ,Sigma 公司)、二氯甲烷、正己烷、异丙醇、双蒸水。

2.仪器:声振仪(X L 2020)、高速分散均质机(F J -200)、真空冷冻干燥机(FD -1)、超速离心机(J2-MC )、光学显微镜、电子天平(FA 2004A )、磁力搅拌器:(C JJ -1)、微型旋涡混合器(H -1)、扫描电镜(KYKY 2000)、紫外可见分光光度计(UV1-160型,岛津)。

(二)制备方法采用双乳化法(乳化溶剂蒸发法)与真空冷冻干燥技术,具体步骤如下:1.电子天平精密称取1.0g P LG A,加入盛有20ml 二氯甲烷的烧杯中,充分搅拌至其完全溶解(作连续相)。

2.将10mg盐酸阿霉素(ADM)粉针剂,用3ml双蒸水充分溶解。

3.将上述3ml ADM溶液加入P LG A二氯甲烷溶液中,声振仪声振40s(Am plitude设置为5),成橘红色乳化液(W/O微球)。

4.将该乳化液(分散相)倒入4%PVA溶液中(连续相),均质机中速均质5min(W/O/W微球)。

5.然后加入100ml2%异丙醇溶液中,室温下磁力搅拌机匀速搅拌2～5h,使微球表面固化、二氯甲烷尽量自然挥发。

6.将上述液体分装入10ml离心管中,高速离心5min(3000r/min),弃上清液。

7.重新加入适量双蒸水,用旋涡混合仪充分混匀、洗涤、离心(3000r/min,5min),弃上清液。

共洗涤、离心3次。

8.加入适量正己烷溶液,用旋涡混合仪充分混匀、洗涤(进一步去除残留的二氯甲烷),用吸管小心吸去离心管上层的正己烷溶液,将盛有P LG A微球的离心管置室温下自然干燥。

9.待其室温干燥后加入适量双蒸水,旋涡混合仪充分混匀,置-70℃冰箱中冷冻30min。

10.置-45℃真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥48h,得橘红色粉末状包裹阿霉素和空气的P LG A微泡声学造影剂(ADM-P LG A微泡声学造影剂)。

11.称重后将其置4℃冰箱中保存、备用。

二、ADM-P LG A微泡声学造影剂形态学观察取适量ADM-P LG A微泡声学造影剂冻干粉,双蒸水复溶后,用普通光学显微镜和扫描电镜进行形态学观察,激光测径仪检测其粒径大小和分布。

三、ADM-P LG A微泡声学造影剂体外及体内显影试验(一)仪器美国GE公司Vivid7型彩色多普勒超声诊断仪, 12L探头,探头频率7～13MH z。

(二)方法1.体外显影试验(1)称取ADM-P LG A微泡声学造影剂冻干粉0125g,将其溶于10ml脱气水中,混匀后盛入特制小水囊内并密封,用10ml脱气水水囊作为对照。

(2)将上述内含ADM微泡声学造影剂的水囊与脱气水水囊同时放入盛有脱气水的容器中进行显影实验,用12L探头在二次谐波模式下(5.2/10.5MH z)对比观察两水囊显影情况。

2.体内显影试验(1)将浓度为5%的ADM-P LG A微泡声学造影剂溶液,按0.25ml/kg剂量,经兔耳缘静脉团注。

(2)然后在二次谐波模式下实时动态观察机械指数(MI)为1.2时,兔肝脏血管、肝实质回声强度增强情况以及肾脏彩色多普勒和能量多普勒血流信号增强情况。

四、ADM-P LG A微泡声学造影剂载药量与包封率测定1.测定波长的选择:采用紫外分光光度计测量微球的载药量与包封率。

取盐酸ADM对照品液(8μg/ml)及空白P LG A微球溶液,以生理盐水为空白对照,在紫外分光光度计上扫描,ADM在波长234nm 处有最大吸收,而P LG A无干扰(图1),故选择波长234nm为测定波长。

图1　紫外分光光度计上扫描,ADM在波长234nm处有最大吸收,而P LG A无干扰,故选择波长234nm为测定波长2.标准曲线绘制:精密称取干燥恒重的ADM对照品2mg置于50ml容量瓶中,以生理盐水定溶,精密量取2ml置于50ml容量瓶中,以同样介质定溶,分别取0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml配成系列浓度,以生理盐水为空白,测定其吸收度值(A),绘制标准曲线,并计算得如下回归方程:药物浓度(C)=16.263A-0.111注:r=0.9999,n=3,线性范围为0.952～14.4μg/m l3.样品ADM含量测定:精密称取一定量的ADM -P LG A微泡声学造影剂,置带塞具的刻度试管中,加入0.5ml二氯甲烷,使微泡外壳聚合物P LG A溶解,再加入5ml 生理盐水振荡30min ,取水层用紫外分光光度计在234nm 处测定其吸收度值(A ),代入标准曲线回归方程计算溶液中ADM 浓度。

微球药物载药量(含量)=微球中的药物质量/称取的微球质量×100%药物包封率=微球中的药物含量/药物理论含量×100%实验结果一、ADM -P LG A 的特性采用本方法制备的ADM -P LG A 微泡声学造影剂,外观为橘红色粉末状(图2),平均产量1.25g 。

微泡水溶性好,能完全溶解于生理盐水中。