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《蔗糖酶的提取及分级沉淀提取综合实验》部分思考计算先预习综合性实验的P25~30以及P49~57；一、熟练酶液蔗糖酶活力测定方法及计算还原糖是分子中含有游离醛基或酮基的单糖或双糖，蔗糖经蔗糖酶酶解作用后，酶解产物的还原糖含量可用3,5二硝基水杨酸比色法测定，与葡萄糖标准工作曲线比较定量计算。
经公式换算可求出酶液中蔗糖酶活力。
糖液中还原糖含量越高，说明蔗糖酶活力越大，可通过蔗糖酶活力的大小，评价酶的提取方法、酶纯化的结果等指标。
蔗糖蔗糖酶葡萄糖果糖酶液中蔗糖酶活力单位计算：利用葡萄糖标准曲线，根据蔗糖被蔗糖酶酶解3分钟后反应液中还原糖的生成量来计算。
设：已知葡萄糖标准工作曲线回归方程为：y =1.56A+0.0051 (y ：单位为mg ；A ：520nm 吸光值)已知：吸取酶解反应液0.2mL ，比色法测得520nm 波长吸光值A=0.670。
求 ：（1）酶液蔗糖酶活力（U/mL ）；(按51页计算公式计算) 答案：13.13（U/mL ）若酶解反应液酶活力高，需稀释后才能检测，换算时注意稀释倍数的换算。
（2）若所提取酶液总体积为20mL ，酶液总酶活力等于多少？答案：262.57(单位)二、酶的分级沉淀提取经酵母破壁提取的酶液除含有蔗糖酶外，还含有其他的杂蛋白，实验中蔗糖酶的分级沉淀提取是一除杂纯化过程。
分级沉淀试剂可用乙醇或硫酸铵，加入酶液的沉淀剂浓度不同，不同种类的蛋白质在不同浓度的脱水剂体系中稳定性的不同，可达到除杂的目的。
加入适量的沉淀剂后，酶液经离心后均有沉淀物产生，沉淀物用缓冲液溶解后，测定溶解液的酶活力大小以及蛋白质含量，可评价沉淀物是以为主还是杂蛋白。
若测定结果蛋白质含量高，但酶活力相对较小，说明此试剂浓度可除去部分杂蛋白未能有效提取蔗糖酶；继续提高试剂浓度，则可能达到有效提取蔗糖酶的目的。
学术部整理分级沉淀实验计算考题：1、室温下取20mL 酶液进行酶的分级沉淀提取实验，沉淀剂选用硫酸铵。
生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理．牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、器材1 、离心机2、．抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计．四、试剂与材料1、牛奶2500mL2、95％乙醇1200mL3、无水乙醚1200mL4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL5、．乙醇—乙醚混合液2000mL五、操作1、将100mL牛奶加热至40℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。
用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟(3 000r／min)。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，弃去上清液。
3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。
最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。
5、准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)得率：测得含量100%理论含量思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1.学习分光光度计的原理和使用方法。
2.学习测定淀粉酶活力的方法。
3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。
淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。
后者可用分光光度计测定。
OH COOH NO 2O 2N OHCOOHO 2N NH 23,5 —二硝基水杨酸还原反应（棕色）休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。
生化实验思考题总汇请学生听从老师安排准备思考题，要求每位同学必须参与。
请组长分配全组同学准备，每个人将思考题做成ppt，将文件发到公用邮箱中或者放在网上，上课提前10分钟到实验室，下载到讲台计算机桌面指定文件夹中，上课时由该位同学讲解。
一般情况下不允许优盘拷贝。
Biochemistry_1@，密码120_122ppt文件名格式为：实验名(汇报人姓名)思考题目录一、总论┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 1二、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究1（亲和层析分离纯化）┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄2三、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究2（考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质浓度）┄┄2四、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究3（酶活力、米氏常数、最大反应速度）┄┄┄┄2五、细胞色素c的制备及其含量测定┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3七、免疫印迹Western blotting ┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3八、酶联免疫吸附测定（间接法）┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 4一、总论——实验前需要了解的实验技术1．层析技术：亲和层析，吸附层析，凝胶过滤层析，离子交换层析，了解各种层析技术的原理，使用的仪器2．离心技术：低速离心，高速离心，离心应注意的问题3．可调式移液器的使用：操作及注意事项4．分光光度计的使用：紫外分光光度计，可见分光光度计，酶标仪5．酶活力，米氏常数，最大反应速度，比活力的概念及常用的测定方法6．测定蛋白质浓度的几种常用方法，了解其原理及其优缺点7．聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、分类、介质、染色方法等8. 生物大分子提取制备技术：盐析，盐溶，等电点沉淀，有机试剂沉淀，透析等，了解其原理及操作9. 免疫印迹法（Western blotting）及酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理二、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究1（亲和层析分离纯化）1. 了解谷胱甘肽转硫酶。
生物化学实验思考题Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】生物化学实验思考题1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在间苯二酚反应，在酸的作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。
2.α—萘酚的反应原理是什么糖在浓的无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及其糠醛的衍生物，后者能与α—萘酚生成紫红色物质。
3.菲林试剂和本尼迪凯特氏法检验糖的原理是什么它们都是含有Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身还原成红色或者黄色的CuO沉淀。
24.何谓纸层析法用滤纸作为惰性支持物的的分层层析法。
5.何谓Rf值影响Rf值的主要因素是什么纸层析法形成的纸层析图谱上，原点到层析点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值；影响Rf值的因素有：物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
6.怎样制备扩展剂扩展剂是4份水饱和的和1份醋酸的混合物。
将20ml和5ml冰醋酸放入中，与15ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗中的则为扩展剂。
7.层析缸中的平衡剂的作用是什么平衡剂起到使纸上吸附的溶剂达到饱和。
使物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中溶解度不同而进行分离。
8.通过蛋白质及氨基酸的呈色反应实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法他们的原理是什么四种：双缩脲反应；茚三酮反应；黄色反应；考马斯亮蓝反应。
（1）双缩脲在碱性环境中能与Cu2+ 生成紫红色化合物，蛋白质中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
（2）除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应产生蓝紫色物质。
（3）含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙色的硝醌酸钠。
（4）考马斯亮蓝G250有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈现棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
1. 氨基酸的纸层析分离1. 什么是纸层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质差异，使其以不同速度移动的一种物理分离方法。
2. 什么是分配系数分配系数是指溶质在固定相中的浓度和溶质在流动相中的浓度的比值。
3. 层析技术的种类1 吸附层析2 分配层析3 离子交换层析4 凝胶过滤层析5 亲和层析6 气象层析7 固相层析8 柱层析9 纸层析10 薄层层析11 高效液相层析4. 影响Rf值的因素有哪些1 纸层析时纸层析时要在密闭仪器中加入平衡试剂使纸层析上吸附的溶剂达到饱和.2 滤纸要保持洁净,点样时要适量斑点不能过大.3 样品物分子结构和极性4 滤纸的厚薄和纤维松紧度不一样，结合的水量也不一样。
2. 酵母RNA的提取和分离1. 试验中为什么选择干酵母做实验材料？酵母中RNA含量较高（2.67%~10.0%），DNA含量少2. 提取RNA的方法有几种？稀碱法和浓盐法3. 加入酸性乙醇的目的？在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可使解聚的核糖核酸沉淀，由此得到RNA的粗制品。
4. 如何鉴定RNA的组分？现象如何？RNA中含有核糖，碱基，磷酸各组分。
核糖与浓盐酸和苔黑酚共热产生绿色；嘌呤碱与银铵络离子共热白色絮状嘌呤银化物沉淀；磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
3. 球蛋白提取及含量测定1. 蛋白质沉淀方法有哪些？分可逆沉淀法和不可逆沉淀法两种。
其中可逆沉淀法有等电点沉淀，中性盐沉淀法，有机溶剂沉淀法；不可逆沉淀法有加热沉淀，重金属盐沉淀，生物碱沉淀。
2. 蛋白质含量测定的方法紫外分光光度计，可见光光度计，双缩脲法，福林酚法3. 分光光度计的使用及注意事项1 接电源，打开样品室暗箱盖，预热20min2 调节所需波长3 开盖放黑色比色皿，关盖，调T%为0%4 放空白对照，放样品液到比色皿2/3到3/4处，用擦镜纸擦干表面，在对照组处调T为100%5 调节T%到ABS，分别测各样品分光光度值4. 盐析原理将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀.4. 影响酶促反应速度的因素1. 影响酶促反应速度的因素有哪些？温度，pH，抑制剂，激活剂2. 唾液淀粉酶的抑制剂，激活剂分别是？激活剂：Cl-；抑制剂：Cu2+3. NaOH对v反应实验，做碘反应实验前为何加盐酸因为碘遇NaOH变NaI和NaIO3，而不能与淀粉发生反应，所以加入盐酸中和氢氧化钠。
第二章蛋白质化学学习要求一、掌握蛋白质分子平均含氮16％的意义，20种氨基酸名称(及三字符号)，R结构特点及分类法；蛋白质一、二、三、四级结构基本特点；蛋白质生物学功能。
二、熟悉蛋白质重要的理化性质；其他为应了解的内容。
习题一、名词解释1．等电点(pI) 2．肽键 3．蛋白质的变性作用 4．非编码氨基酸 5.α螺旋 6．结合蛋白 7．盐析作用 8．亚基 9．分子病 10．透析二、思考题1.不同蛋白质的含量颇为相近，平均含量为％。
2.20种基本氨基酸可以分为哪几类？其分类依据是什么？其中，酸性氨基酸和碱性氨基酸各包含哪几种氨基酸？3.蛋白质的一、二、三、四级结构的各自定义及其特点。
4.蛋白质的二级结构有哪些？维持二级结构的化学键是？5.维持蛋白质一级结构的化学键是键，而维持蛋白质高级结构的化学键有哪些？6.如果组成蛋白质的2条多肽链之间存在共价键（如二硫键），就没有四级结构。
7.试说明蛋白质结构与功能的关系。
8.维持蛋白质亲水胶体稳定的两个因素是？9.引起蛋白质变性的理化因素有哪些？蛋白质变性后，其理化性质．．．．和生物学活性．．．．．会发生怎样的改变？10.沉淀蛋白质的方法有哪些？其中法在常温下沉淀出的蛋白质不变性。
11.试举二例说明蛋白质变性在医学、食品工业等实践中的应用。
12.蛋白质和核酸对紫外光均有吸收。
蛋白质的最大吸收波长是 nm；核酸的最大吸收波长是 nm。
13.蛋白质的生理功能有哪些？试从含量及生理功能说明蛋白质在生命过程中的重要性。
14.氨基酸的等电点和中性点(pH 7.0)有何区别?15.如将氨基酸混合液(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)点在滤纸上，在pH6.8的缓冲液中进行电泳，试推测它们从正极至负极的顺序。
第三章酶学学习要求一、掌握酶的概念与作用特点(催化效率高、专一性强、不稳定性及可调控性等)．酶蛋白、辅助因子(辅酶或辅基)、参与辅酶或辅基组成的B族维生素及其功能、全酶；必需基团与活性中心；酶原激活及同工酶概念。
思考题实验：糖的颜色反应、蛋白质及氨基酸的呈色反应P521、鉴别蛋白质的方法有哪些？简述其原理。
（1）.灼烧产生烧焦羽毛的气味是蛋白质。
（2.）遇浓HNO3变性产生黄色不溶物是蛋白质。
原理：蛋白质中含有苯环的氨基酸遇硝酸硝化。
（3.）磨浆过滤，取滤液，先加NaOH，再加入双缩脲试剂，出现紫色反应，就为蛋白质。
原理：铜离子在碱性条件下与两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键发生反应，生成紫色络合物。
2、能否利用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在？为什么？不能，和茚三酮反应的除了蛋白质外还有胺和氨基酸类等，它不是蛋白质的专一试剂。
实验：蛋白质沉淀反应P541、用蛋清作为铅或汞中毒的解毒剂的依据是什么？铅和汞是重金属，会使蛋白质变性，而人体组织中蛋白质是必不可少的组成成分，比如胃、食道等组织。
误服铅或汞后，吞入大量鸡蛋清（鸡蛋清中含有大量蛋白质），可使铅与汞先与蛋清反应，减少与机体组织的接触，进而减轻毒性。
2、在蛋白质的沉淀反应里，哪些是可逆的，哪些是不可逆的？不可逆：重金属盐沉淀蛋白质，乙醇沉淀蛋白质，生物碱试剂沉淀蛋白质。
可逆：蛋白质盐析作用。
实验：卵磷脂的提取和鉴定P301、卵磷脂提取的过程中，加入热95%的乙醇的作用是什么？增加溶解度2、卵磷脂的生物学功能有哪些？是生物膜的重要组成成分；促进脂肪代谢，防止出现脂肪肝；促进体内转甲基代谢的顺利进行；具有免疫调节功能；促进神经传达。
实验：酵母RNA的提取与鉴定P1261、加热提取RNA后为什么要加乙酸中和至微酸性？乙酸能不能多加？为什么？.加热后中和至微酸性可以除去蛋白质、多糖等杂质，不能多加，否则RNA会酸水解。
2、加乙酸后进行离心分离，上清液及沉淀物中各主要含什么物质？上清液主要为RNA，沉淀物中主要含蛋白质、多糖等杂质。
3、除了稀碱法外，还有没有其他提取RNA的方法？他们各有何优缺点？1、苯酚法；2、去污剂法、3、盐酸胍法。
生物化学实验思考题文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
生物化学实验思考题
1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？
间苯二酚反应，在酸的作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。
2.α—萘酚的反应原理是什么？
3.
糖在浓的无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及其糠醛的衍生物，后者能与α—萘酚生成紫红色物质。
4.菲林试剂和本尼迪凯特氏法检验糖的原理是什么？
它们都是含有Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身还原成红色或者黄色的Cu
O沉淀。
2
5.何谓纸层析法？
用滤纸作为惰性支持物的的分层层析法。
6.何谓Rf值影响Rf值的主要因素是什么
7.
纸层析法形成的纸层析图谱上，原点到层析点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值；影响Rf值的因素有：物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
8.怎样制备扩展剂？
扩展剂是4份水饱和的和1份醋酸的混合物。
将20ml和5ml冰醋酸放入中，与15ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗中的则为扩展剂。
9.层析缸中的平衡剂的作用是什么？
平衡剂起到使纸上吸附的溶剂达到饱和。
使物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中溶解度不同而进行分离。
10.通过蛋白质及氨基酸的呈色反应实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法他们的
原理是什么
11.
四种：双缩脲反应；茚三酮反应；黄色反应；考马斯亮蓝反应。
（1）双缩脲在碱性环境中能与Cu2+ 生成紫红色化合物，蛋白质中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
（2）除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应产生蓝紫色物质。
（3）含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙色的硝醌酸钠。
（4）考马斯亮蓝G250有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈现棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
12.什么是酶的最适温度及其应用的意义？
酶活性最高时的温度称为酶的最适温度。
可以利用这一原理指导工农业生产，提高生产效益。
13.什么是酶反应的最适PH对酶的活性有什么影响
14.
酶催化活性最高时反应体系的 pH 称为酶促反应的最适 PH。
PH过高、过低都会使酶促反应的速率下降。
15.什么是酶的活化剂？
指能够与分子上的一些结合，使酶活力提高的物质。
16.什么是酶的抑制剂与变性剂有何区别本实验结果如何证明酶的专一性
指与分子上的一些结合，使酶活力下降，甚至消失，但不使变性的物质。
区别：酶的抑制剂不会使酶发生变性，而酶的变性剂会使酶的结构和性质发生改变。
酶的专一性证明：实验结果表明通过在淀粉和蔗糖中分别加入有活性的淀粉酶和蔗糖酶后，两者均产
生了还原性的糖，与本尼迪凯特试剂反应产生了砖红色沉淀，而其他的条件下均没有还原性糖的的产生，进而说明了酶的专一性。
（答题时可以详尽的描述）
17.何谓碘值有何意义
18.
指100g脂肪在一定条件下吸收碘的克数。
意义：碘值是鉴别脂肪的一个重要参数，可以用来判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。
空白溶液：在各种分析方法中，为消除干扰，除不加待测样品外与测定试样时完全一致的条件进行测定的溶液。
空白实验：是在不加的情况下，用测定样品相同的方法、步骤进行定量分析，把所得结果作为空白值，从样品的分析结果中扣除。
这样可以消除由于不纯或试剂干扰等所造成的系统误差。
其是分析化学实验中常用的一种方法，它可以减小。
21.何谓蛋白质的等电点和沉淀反应有何实用的意义
22.
蛋白质等电点：当溶液的PH达到一定的数值时，蛋白质颗粒上的正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH称为此种蛋白质的等电点。
沉淀反应：蛋白质在某种理化条件下，蛋白溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白相互聚集的现象。
实用意义：分离纯化以及提纯蛋白质等生化相关领域。
23.如何正确测定酶促反应的速度？
（1）底物必须要保证有足够的底物，能使酶完全发挥其功能；（2）时间的控制根据酶促反应曲线可以看出，最开始斜率比较大，然后趋于平缓（这种原因可能是生成的产物促进你反应或酶失活），因此，如果测定的时间选择不当，测定的速度也不是初速度，所以在测定的时间必须掌握在斜率比较大的那段时间内。
当然，除此之外，还需给酶提供最适温度，最适pH，保证没有抑制剂存在等。
胰蛋白酶可以催化蛋白质中的碱性氨基酸（L-
精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键发生水解，水解时形成自由的氨基，可以用甲醛滴定氨基，产生的H+，用标准溶液NaOH的消耗量对时间作图，斜率即是酶促反应的速度。
24.用实验所得的反应速度的数据，对相应的底物浓度作图。
由所得的曲线看出底物浓度
对酶促反应的影响有何特殊规律？
当底物浓度较低时（一级反应），底物浓度与酶促反应的速率成正比；随着底物浓度的增加（混合级反应），酶促反应的速率随底物浓度的增加非线性缓慢增加；当底物浓度达到一定的限度后，酶促反应的速率保持不变。
25.试述本实验介绍的2,6—二氯酚靛酚滴定法的优缺点。
优点：简便易行，快速。
缺点：（1）准确性差，滴定终点难以把握；（2）生物组织的提取液中VC还能以脱氢和结合的形式存在，这两种情形的VC都具有还原型VC的生物活性，却不能将2,6—二氯酚靛酚还原脱色；（3）生物组织液中的提取液中常含有天然色素，干扰滴定终点的颜色观察。
