大鼠骨髓间充质干细胞分离培养标记及向移植肺趋化的实验研究

陕西医学杂志２００７年５月第３６卷第５期　

大鼠骨髓闻充质千细胞体外分离培养的实验研究　

第四军医大学西京医院呼吸内科（西安７１００３２）　

赵　峰　李圣青　张字飞　陈卫强　侯志峰。　吴昌归　戚好文　

摘　要　目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）体外分离、培养的适宜条件。方法：　

采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓ＭＳＣｓ，观察其形态，流式细胞仪检　

测细胞表面标记，ＭＴＴ法观察不同浓度的胎牛血清（ＦＢＳ）对ＭＳＣｓ生长曲线的影响及不同　

代ＭＳＣｓ的生长曲线和细胞贴壁率。结果：大鼠ＭＳＣｓ呈梭形或纺锤形，ＣＤ　ＣＤ　表达阴　

性，ＣＤ。。表达７１．５　、ＣＤｌ６６表达８３．２％；ＭＳＣｓ用１Ｏ　的ＦＢＳ培养，其增殖明显高于用无血　

清、５％及２ｏ　的ＦＢＳ培养；第１、３、５、１ｏ代ＭＳＣｓ的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异（Ｐ　

＞０．０５）。结论：密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠ＭＳＣｓ的分离；１０％的ＦＢＳ适合　

ＭＳＣｓ的培养；早期传代对ＭＳＣｓ的增殖无影响。　

主题词　骨髓间充质干细胞　细胞分离　培养基，条件性　体外研究　动物，实验　

大鼠　

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—－ｄｅｒｉｖｅｄ　

ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｊｉｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｘｉ’ａｎ　７１００３２）Ｚｈａｏ　Ｆｅｎｇ　Ｌｉ　Ｓｈｅｎｇｑｉｎｇ　Ｚｈａｎｇ　Ｙｕｆｅｉ　ｅｔ　ａｌ　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ａｎ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　

ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌｓ（ＭＳＣｓ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒａｔ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｃｏｌｌ　ａｎｄ　ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｉｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃａｒｄｅｄ　４８　ｈｏｕｒｓ　ｌａｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｓｈａｐｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ＣＤ３¨ＣＤ４¨ＣＤ４＂ＣＤ１　６６　

中国现代药物应用２０１４年８月第８卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍ０ｄ　Ｄｒａｇ　Ａｐｐｌ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏ１．８，Ｎｏ．１５　Ｖ３２５三期临床试验将ＤＣＦ（多西他赛联合顺铂和５－ＦＵ）　和美国的标准ＰＦ方案比较，结果发现，ＤＣＦ方案治疗可以　使疾病进展时间延长（６．６个月Ｖｓ　３．７个月）、缓解率高（３７％　ＶＳ　２５％）、总体生存时间延长（９．２个月ＶＳ　８．６个月）。另有研　究也表明ＤＣＦ方案与ＰＦ方案相比，患者生活质量和临床获　益均佳。鉴于此，美国ＦＤＡ已批准ＤＣＦ方案用于临床。但是，　值得注意的是，ＤＣＦ方案能够引起更多的嗜中性粒细胞减少　症（２９％ＶＳ　１２％），从而需要使用粒细胞集落刺激因子来预防。　而且，该研究中的患者中位年龄为５５岁，远低于其他研究，　因此在普通人群中使用该方案需注意。　另一项Ｍｅｔａ分析表明　包含多西他赛方案可使总体生　存获益，但没达到统计学差异（ＨＲ－－Ｏ．９３，９５％ＣＩ＝０．７５～１．１５）；　疾病无进展生存时间也无统计学差异，可能是因为实验设　计不同造成；缓解率分别为３６％和３１％，亦无明显差异　（ＯＲ＝Ｉ．３０，９５％ＣＩ＝０．９８－１．７２）。　Ａ１一Ｂａｔｒａｎ等比较了ＦＬＯ（５一ＦＵ、亚叶酸钙、奥沙利铂）　和ＦＬＰ（５一ＦＵ、亚叶酸钙、顺铂）方案，前者仅在ＰＦＳ上有优　势，总体生存无差异。但是，在６５岁以上亚群患者中，ＦＬＯ　方案缓解率高（４１．３％ＶＳ　１６．７％，Ｐ＝Ｏ．０１２）、治疗失败时间长　（５．４个月ＶＳ　２．３个月，Ｐ＝Ｏ．００１）、ＰＦＳ长（６．０个月ＶＳ　３．１个　月，Ｐ＝０．０２９）、ＯＳ长（１３．９个月Ｖｓ７．２个月）。简而言之，ＦＬＯ　方案毒性低，对年老患者疗效更好。所以，对于进展期胃癌化　疗，顺铂是世界各地联合方案的基础药物。欧洲的标准方案为　ＥＣＦ，美国为顺铂联合氟嘧啶类，日本则以顺铂联合ｓ１为主。　３．４包含靶向药物的方案　３．４．１三期临床试验临床试验中研究的靶向药物主要有　抗ＥＧＦＲ和抗ＨＲＥ２单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂和血管　生成抑制剂。目前为止，曲妥珠单抗治疗胃癌（ＴＯＧＡ）临床试　验是唯一一个报道的三期临床研究，该实验纳入了５９４例经　免疫组化或荧光原位杂交技术证明ＨＥＲ２过表达（阳性率：　２１％胃癌和３３．２％胃食管交界肿瘤）患者。实验组为卡培　他滨或氟尿嘧啶加顺铂及曲妥珠单抗，对照组不加曲妥珠单　抗，结果表明实验组的中位总体生存时间为１３．８个月，单纯　化疗组为１　１．１个月，两者相比差异具有统计学意义（ＨＲ＝Ｏ．７４，　９５％ＣＩ－－Ｏ．６０～０．９１；Ｐ＝０．ｏｏ４６）；两组缓解率分别为４７．３％和　３４．５％ｆＰ－０．００１７）；二者副反应和心血管事件发生率无明显差　异。在ＨＥＲ２高表达人群中，中位生存时间分别为１６．０个月　・２３９・　和１１．８个月，差异更明显。因此，有人提出，对于ＨＥＲ２表　达阳性的胃癌和胃食管交界处肿瘤，加入曲妥珠单抗的联合　化疗方案不失为一个标准选择。　３．４．２二期临床试验贝伐单抗联合伊立替康＋顺铂或多　西他赛＋奥沙利铂治疗胃癌，ＰＦＳ和ＯＳ分别为７～８个月和　１　１－１２个月，缓解率为６５％一７９％，相关毒性包括中性粒细胞　减少症（３４％）和胃肠道穿孔（６％一８％）。西妥昔单抗（抗一ＥＧＦＲ　单克隆抗体）联合不同化疗方案如氟尿嘧啶／卡培他滨＋奥　沙利铂／伊立替康、多西他赛＋奥沙利铂，缓解率大约为　５０％，疾病无进展时间为５～８个月，主要毒性有中性粒细胞减　少症（４ｏ％）和痤疮样皮疹（２Ｏ％）。另一个抗一ＥＧＦＲ单克隆抗　体Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ联合ＥＯＸ的三期临床试验正在进行。酪氨　酸激酶抑制剂舒尼替尼、索拉菲尼及ｍＴＯＲ抑制剂依维莫司　联合化疗方案亦正在进行中。　综上所述，虽然现代肿瘤治疗方法呈现多元化发展。转　移性胃癌目前仍是一个不可治愈的疾病，其治疗方法的选择　主要考虑患者的生活质量和疾病无进展生存时间。欧洲、美　国和亚洲都有适合各自环境的一线化疗方案，未来研究希望　主要集中在加强细胞毒性药物和靶向药物的特定干预、发现　新的有助于改善目前治疗方案的特异性分子标志物等。　参考文献　［１］Ｍｕｒａｄ　ＡＭ，Ｓａｎｔｉａｇｏ　ＦＦ，Ｐｅｔｒｏｉａｎｕ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｄｏｘｏｒｕｂｉｅｉｎ，ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ　ｉｎ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃ￣ｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３（７２１：３７－４１．　［２　Ｊ　Ｗａｇｎｅｒ　ＡＤ，Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ　Ｓ，Ｇｒｏｔｈｅ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ．Ｇｏｃｈｒａｎｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｓｙｓｔ　Ｒｅｖ　Ｍａｒ，２０１０，　１７（３）：４０６４．　［３］Ｋｅｌｓｅｎ　Ｄ，Ａｔｉｑ　ＯＴ，Ｓａｌｔｚ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．ＦＡＭＴＸ　ｖｅｒｓｕｓ　ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，　ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ａｎｄ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ：ａ　ｒａｎｄｏｍ　ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｒｉａｌ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ，１９９２，１０（４）：５４１—５４８．　［４］Ａｊａｎｉ　ＪＡ，Ｆｏｄｏｒ　ＭＢ，Ｔｊｕｌａｎｄｉｎ　ＳＡ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈａｓｅ　ＩＩ　ｍｕｌｔｉ—　ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　ｐｌｕｓ　ｅｉｓｐｌａｔｉｎ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｕｎｔｒｅａｔｅｄ，ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ，ｏｒ　ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ａｄｅｎｏｅａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ，２００５（２３）：５６６０－　５６６７．　［收稿日期：２０１４—０５—１４］　

广　西　医　科　大　学　学　报　２００８　Ｄｅｃ；２５（６）　ＪＯｕＲＮＡＩ　ＯＦ　ＧＵＡＮＧＸＩ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　・　８２５　・　

改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究　

余劲明　蔡德鸿　张桦袁小澎李　明　陈宏△　（南方医科大学珠江医院内分泌科广州　５１０２８２）　

摘要　目的：改良大鼠骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）原代分离方法，探讨大鼠ＭＳＣｓ体外培养的适宜条件。方法：比较改良与传　统单纯贴壁培养法、密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠ＭＳＣｓ，观察不同方法获得原代细胞形态及不同代ＭＳＣｓ的　生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标记，同时观察不同浓度的胎牛血清（ＦＢＳ）对ＭＳＣｓ生长曲线的影响。结果：改良单纯贴　壁培养法获得的原代细胞贴壁时间早、生长快，与其他两种分离方法差异明显（Ｐ＜Ｏ．０１）；原代ＭＳＣｓ用１５　的ＦＢＳ培养，其　增殖明显高于５　、１０　及２Ｏ　的ＦＢＳ培养；第３代以后ＭＳＣｓ用５％的ＦＢＳ培养有力于细胞纯化。结论：成功地改良了分离　培养大鼠ＭＳＣｓ的方法，配合不同血清浓度培养基可使收获ＭＳＣｓ效率增高。　关键词　骨髓间质干细胞；大鼠；细胞培养；改良　中图分类号：Ｒ３２９．２　８　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—９３０Ｘ（２００８）０６　０８２５—０４　

ＩＭＰＲｏＶＥＤ　ＩＳｏＬＡＴＩｏＮ　ＡＮＤ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ｏＦ　ＲＡＴ　ＢｏＮＥ　ＭＡＲＲｏＷ—ＤＥＲＩＶＥＤ　ＭＥＳＥＮＣＨＹ—　ＭＡＬ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　Ｙｕ　Ｊｉｎｍｉｎｇ，Ｃａｉ　Ｄｅｈｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｈｕａ，ｅｔ　ａ１．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１ｏｇｙ，Ｚｈｕｊｉａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａ１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａ１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０２８２　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ａｎ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒａｔ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｎｏｎ—ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｅｏｌｌ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｓｈａｐｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ＭＳＣｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）ｗａｓ　ｏｂ—　ｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｏｂｔａｉｎ　ｍｏｒｅ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｃｈ　ｇｒｏｗ　ｆａｓｔ　ｔｈａｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＜０．Ｏ　１）．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ＭＳＣｓ　ｗｉｔｈ　１　５　ＦＢＳ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｏｓｅ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＦＢＳ．ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　５　ＦＢＳ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　３ｒｄ　ｐａｓｓａｇｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕ１　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ＭＳＣｓ．Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＦＢＳ　ｃａｎ　ｈｅｌｐ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ＭＳＣｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｒａｔ：ｃｅｌ１　ｃｕｌｔｕｒｅ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　

脊柱外科杂志，２０１３年１Ｏ月，第１１卷５期Ｊ　Ｓｐｉｎａｌ　Ｓｕｒｇ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１３，Ｖｏｌ　１１，Ｎｏ　５　・３０７・　

常用的ＢＭＳＣｓ分离培养方法包括：全骨髓差速　

贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离和免疫磁　珠分离法　Ｊ。流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离　

法虽可获得高纯度的ＢＭＳＣｓ，但操作步骤烦琐，成　本高，对细胞的生物学特性存在一定影响，应用范围　

有限。本研究采密度梯度离心结合差速贴壁法进行　大鼠ＢＭＳＣｓ培养，该方法操作简便，对细胞增殖活　

力影响小，便于ＢＭＳＣｓ快速扩增，同时由于结合了２　种分离方法的优点，在细胞纯化方面更具优势。本　研究先通过密度梯度离心获得纯度相对较高的单核　

细胞进行培养，避免过多杂细胞混入，再结合差速贴　

壁法利用ＢＭＳＣｓ贴壁较早的特性，于接种后４　ｈ进　行首次换液，进一步去除未贴壁的造血细胞等悬浮　

细胞，所获得的大鼠ＢＭＳＣｓ纯度高，Ｐ３代大鼠ＢＭＳＣｓ　纯度＞９８％，优于单纯采用密度梯度离心法和全骨　

髓差速贴壁法的文献报道［１０—１　１］。　由于ＢＭＳＣｓ缺乏特异性的标志物，目前主要通　

过对细胞形态、多种表面标志物和多向分化潜能的　

检测来鉴定。本研究所培养的大鼠ＢＭＳＣｓ具有类　似成纤维细胞样梭形形态，并呈漩涡状或鱼尾纹状　

排列，符合ＢＭＳＣｓ的形态特征。流式细胞仪检测进　

一步显示该细胞表达间质细胞标志物ＣＤ４４和干细　胞标志物ＣＤ９０，不表达造血前体细胞表面标志物　

ＣＤ３４和白细胞表面标志物ＣＤ４５，具有间质细胞和　干细胞特征，但不属于造血前体细胞和白细胞，亦符　

合ＢＭＳＣｓ特性　。多向分化潜能检测是鉴定　

ＢＭＳＣｓ的另一重要标准　。本研究将大鼠ＢＭＳＣｓ　

分别行成骨、成脂诱导后发现其可向成骨细胞和脂　肪细胞分化，具有成体干细胞特性，符合ＢＭＳＣｓ鉴　

定标准。上述鉴定结果表明本研究采用密度梯度离　

心法结合差速贴壁法所培养的正是大鼠ＢＭＳＣｓ。　虽然多数学者认为中胚层来源的ＢＭＳＣｓ在一　定条件下可向外胚层来源的神经元样细胞分化¨　，