小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是

骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能

力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已 经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然 MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的 具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之 一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养 MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能

调控机制的前提。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。然而全骨髓贴壁法获得的细胞往 往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶 消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽 然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞

相对少。

骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不 贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。然而该 方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细 胞污染。我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培 养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代， MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。 骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪 碎，然后进行胶原酶消化。虽然该方法获的 MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶 原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面 抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细 胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这 些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细 胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和 技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将 股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消化， 直接剪碎，PBS洗后重悬于培养基直接接种。相比 全骨髓贴壁法及骨片消化法发现，骨髓加骨片法出 现小鼠MSC集落的时间早，数量多。虽然第1代消 化细胞仍有少量CD45阳性细胞，但到第3代，MSC 纯度可达95％以上，而且获得的MSC总数要高于全 骨髓贴壁法及骨片消化法。与其他方法获得的 MSC相似，3代后骨髓加骨片法获得的MSC高表达 Sca-1，CD44，CD29等，不表达内皮细胞标志CD31 及造血细胞标志CD45。该方法获得的．MSC在成骨 和成脂诱导体系中培养能分化为成骨细胞和脂肪细 胞。 综上所述，骨髓加骨片法充分利用了骨髓及骨 片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态 良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快 捷、高效的MSC分离培养方法。

分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法

一、分离方法说明及图例

A.

Ⅰ. 取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-

TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；

Ⅱ. 取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约

1500转/分）离心5分钟，弃去上清。沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；

B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃

-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；

C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；

D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—

1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采

用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）

E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；此时，离心管中由上至下分为四层：第一层；为稀释液层。第二层；为环状乳白色含所需干细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为极少数红细胞层。收集第二层细胞

放入约为其5-

10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1

5分钟。沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。

F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀

粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-

30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。沉淀经反复洗涤

骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及

成脂、成骨诱导分化

一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS

平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移

至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，

浸泡于PBS溶液中。3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，

剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨

髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为

单个细胞。4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均

匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不

要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2

次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。原代培养6-7d

后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。

图1：BMSCs原代培养6-7d

二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添

加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM

地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。3d换液1次，分

化12d。

待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％

中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液

浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去

染液，倒置显微镜下观察拍照。

成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆

并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。

图2：BMSCs成脂诱导5d

三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添

加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM

地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。3d换液1

一 造血干细胞分离

（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备

1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法

抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。

2 percoll液密度梯度离心法

①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20

min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。

②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。

3 Ficoll分离法

方法一 在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。

方法二 取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。

取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。