肽指纹图谱PMF鉴定

浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。

关键词：蛋白质质谱分析原理与方法蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。

作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。

关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。

随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

1 蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。

经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。

在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。

这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。

要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。

对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。

后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。

我公司应用ABI公司4800质谱仪为广大蛋白质研究者提供质谱分析服务。

美国ABI公司4800 plus MALDI—TOF/TOF质谱仪（基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱）具有极高的分辨率和灵敏度，灵敏度只需要纳克级的蛋白质。

蛋白质质谱分析常规项目包括：·蛋白质鉴定(肽指纹图谱PMF，串联质谱分析)·大分子蛋白质质量测定肽指纹图谱（PMF）鉴定PMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根据一级质谱（MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的一种方法。

一般采用MALDI-TOF仪器进行。

因为MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。

其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定。

二级质谱鉴定质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质。

常用MALDI-TOF／TOF仪器进行。

具体收费及详情，请联系嘉美生物.嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。

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蛋⽩质、多肽等⼤分⼦的质谱分析蛋⽩质、多肽等⼤分⼦的质谱分析检测仪器:1、基质辅助激光解吸附电离飞⾏时间质谱(MALDI-TOF MS)2、基质辅助激光解吸附电离串联飞⾏时间质谱(Autoflex III MALDI-TOF/TOF)3、纳升液相电喷雾四级杆飞⾏时间串联质谱仪(micrOTOF-Q II? ESI-Qq-TOF)主要应⽤:1、⽣物⼤分⼦的分⼦量检测2、蛋⽩质、多肽的纯度鉴定3、蛋⽩质的肽指纹图谱检测4、混合组分的分⼦量分布检测5、合成物质的分⼦量检测与纯度评价6、重组蛋⽩的分⼦量检测与纯度评价7、蛋⽩质的多肽谱检测8、⾎清多肽谱的检测9、PEG修饰的蛋⽩药物的研究样品要求:1、样品含量: 50-100Fmol (液体约5ul)2、样品形式: 液体；⼲粉；胶粒/条带3、⾮胶样品: 挥发性盐<20mM，⽆PBS、SDS和尿素等物质4、胶类样品: 银染过程中未使⽤戊⼆醛作为固定剂5、保存⽅式: 液体建议低温，胶类⽤去离⼦⽔防⼲蛋⽩质及多肽质谱鉴定简介博奥⽣物有限公司蛋⽩质实验室于2006年开始对外提供多肽和蛋⽩质测试服务，包括多肽和蛋⽩质的分⼦量和序列测定，蛋⽩种类鉴定。

博奥采⽤串联质谱法（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）鉴定蛋⽩，可靠性⾼。

蛋⽩经胰酶消化形成的肽段进⼊质谱，⼀级质谱检测多肽分⼦的⼤⼩，然后再将肽段打碎，形成⼀系列离⼦即N端离⼦系列（B系列）和C端碎⽚离⼦系列（Y系列）。

质谱再检测碎⽚离⼦的⼤⼩，即⼆级质谱。

将质谱数据与蛋⽩数据库进⾏⽐对，获得肽段的序列，特定的多肽序列对应着特定的蛋⽩，从⽽鉴定出待检测蛋⽩。

除了鉴定单个蛋⽩，我们的液相⾊谱和质谱联⽤平台（Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）还具有分析混合蛋⽩的能⼒。

MALDI-TOF MS（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是另⼀种常⽤的质谱平台，通过肽指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）来鉴定蛋⽩质。

MALDI- TOF介绍MALDI- TOF的特点及其应用领域基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI- TOF)工作原理是：将样品与能强烈吸收激光的基质配成溶液，溶剂挥发后形成的“固体溶体”进入离子源，激光照射“固体溶体”，基质吸收能量并传递给样品形成离子，样品离子进入飞行时间质谱仪中进行检测。

MALDI- TOF能在短时间内迅速发展，归结于它具有如下特点：(1) 质量检测范围宽(已超过300KD a);(2) 质量的准确度高(达0.01%);(3) 灵敏度(尤其是全质量范围灵敏度) 高，样品量只需1pmol 甚至更少；(4) 对样品要求很低，能忍耐较高浓度的盐，缓冲剂和非挥发性杂质；(5) 分析速度快，分子离子峰强，信息直观。

由于MALDI- TOF的上述优点，MALDI- TOF在测定大分子化合物，尤其是蛋白，核酸，多糖，脂类等生物大分子上是其他质谱所无法代替的。

在蛋白质组学研究，基因组研究以及生物天然药物的开发等领域起到了重要的作用。

进几年来，又在分析有机小分子，有机金属簇化合物，低聚物，元素高分子，光电材料，缩聚反应等上取得重大进展，已逐步发展成为现代化学分析中一项普通实用的，快速高效的检测手段。

1 在蛋白质及蛋白质组学等生命科学研究中的应用MALDI- TOF在多肽和蛋白的分析领域，相对来说已比较成熟，用胰蛋白酶或羧肽酶Y酶解，通过测肽指纹图谱(PMF) 鉴定蛋白，或者通过利用MALDI离子源特有的能生成亚稳态离子，可发生源后裂解(PSD，post source decay) 分析多肽的氨基酸序列，并已有许多成功的例子。

核酸的分析最近取得重要的进展，用Er.YAG激光器(2.94um) 及甘油为基质可观测到含2180个碱基对的DNA的准分子峰，所需样品量为fmol水平。

因此，MALDI- TOF也可用于基因组研究中遗传多样性的分析。

2 在高分子材料研究中的应用目前，在分析合成高分子的手段中，质谱越来越表现出它的重要性。

百泰派克生物科技
二级质谱图多肽鉴定
二级质谱图多肽鉴定是指利用多肽的二级质谱谱图即肽质量指纹图谱（PMF）承载的信息对多肽进行鉴定分析，包括多肽定性定量分析、结构分析、氨基酸序列分析以及翻译后修饰情况分析等。

二级质谱通俗理解就是在一级质谱的基础上进行第二轮质谱分析。

多肽二级质谱分析通过选择一级质谱中的特殊肽段母离子再次进行破碎检测，可以得到更多的子离子质谱信息，从而为更多分析如结构、含量、序列等鉴定提供数据支持。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC 纳升色谱,
提供高效精准的多肽二级质谱鉴定分析技术包裹，通过分析更多的目标肽段离子碎片信息可实现多种多肽鉴定分析，鉴定耗时短、结果可信度高，还可以根据需求提供定制化的检测方案，欢迎免费咨询。

MS（mass spectrum）质谱法：一种测量离子质荷比的分析方法tamdam-MS 串联质谱：将两个或更多质谱连接在一起。

MALDI（Matrix-Assisted laser Desrption Ionization）基质辅助激光解吸电离离子源：用激光照射样品与基质形成的光结晶薄膜、基质从激光中吸收能量传递到生物分子，而电解过程中将质子转移到生物分子或生物分子得到质子而使生物分子电离的过程ESI（Electron spray Ionization）点喷雾离子源：属于一种软电离源，能使大质量的有机分子生成多电荷的离子。

2D-DIGE（two dimension difference gel electrophoresis）一种新的荧光标记的定量蛋白质组学技术。

利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像。

zoom gel 变焦镜头凝胶成像：利用百变焦镜头的设备对凝胶进行拍摄成像。

two-in-one-gel 二合一凝胶：将相同PH范围胶条一起进行SDS-PAGE的技术SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell culture）细胞培养下稳定同位素标记技术）：是在细胞培养过程中，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白表达进行定量分析的技术。

CDIT（charge detection ion trap）电荷检测离子阱：一种将离子通过电磁场限定在有限空间内的设备，用于多级质谱分析。

ICAT（Isotope Coded Affinity Taq）同位素亲和标签技术:用具有不同质量同位素亲和标签标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术对混合样品进行质谱分析。

iTRAQ（isobaric taqs fur relative and absolute guentitation）同位素标记相对和绝对定量技术：该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪分析，可同时比较8种样品间蛋白表达量。

方法：质谱法原理：一、利用MALDI-TOF质谱仪根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。

优点：速度快，通量高，方法简便。

缺点：灵敏度不足，可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。

肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。

肽段分子质量在2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降。

蛋白质数据库仍不完善。

二、利用ESI-MS质谱仪由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。

根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。

优点：通过串联质谱大大增加了蛋白质鉴定的准确性。

对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。

采用纳升喷雾提高检测的灵敏度。

缺点：通量与速度不如MALDI。

数据库检索比较费时。

仪器：BrukerAutoflex Ⅱ（MALDI-TOF-TOF-MS）；Finnigan LCQ Deca Xp / Finnigan LTQ样品要求：1、防止角蛋白污染2、样品状态：液体、固体或胶内蛋白质（接受考马斯亮兰染色和银染样品鉴定）3、含盐量：挥发性无机盐< 20 mM; 不挥发性无机盐< 5mM4、不少于200 ug /一块胶（银染）；5、胶内蛋白质鉴定，蛋白质样品量不少于1mg/一块胶（考马斯亮兰染色）蛋白质鉴定结果常见问题：1、由于角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。

2、由于蛋白量过少引起鉴定结果的评分低，可信度不高。

3、由于蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。

4、由于蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。

注意事项：1、推荐采用考马斯亮兰染色。

因为该方法的成功率较高，而银染的成功率则会低很多。

2、银染的方法为快速银染法。

常规银染法不适用质谱鉴定。

3、考马斯亮蓝染色样品的上样量>1mg4、银染法得上样量>0.6mg。

2010年一．名词解释1.表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。

这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。

表观遗传改变从以下3个层面上调控基因的表达，DNA修饰：DNA共价结合一个修饰基团，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态；蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因表达的调控；非编码RNA的调控：RNA可通过某些机制实现对基因转录的调控以及对基因转录后的调控，如RNA干扰(RNA interference,RNAi)。

表观遗传学研究包括染色质重塑、DNA甲基化、X染色体失活，非编码RNA调控4个方面，任何一方面的异常都将影响染色质结构和基因表达，导致复杂综合征、多因素疾病以及癌症。

2.肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)测定对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。

质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出所测蛋白是已知还是未知。

由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。

采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。

3. RNA剪接RNA splicing除去初级转录产物中的内含子，并将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子的过程。

4. 管家基因house-keeping gene生物体各类细胞中都表达，对维持细胞存活和生长所必需的蛋白质编码的基因。

5. frameshift mutation在基因编码区，核苷酸插入或缺失导致三联体密码子阅读方式的改变，从而使该基因的相应编码序列发生改变。

6. DNA binding domainDNA结合域7.Shine-dalgarno sequence SD序列SD序列是原核生物mRNA中5＇端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游3至11个核苷酸处,并且同16S rRNA 3＇端的序列互补。

百泰派克生物科技
蛋白组学肽质量指纹谱
蛋白质的鉴定方法主要是利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、氨基酸组成和序列、肽质量指纹图谱等在蛋白质数据库中进行检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。

肽质量指纹图谱（Peptide mass fingerprint，PMF）是指利用质谱检测获得的肽片段质量进行蛋白质鉴定的技术，被认为是鉴定蛋白质最快速、最有效的方法。

其基本原理是利用质谱仪检测到的蛋白质各种肽片段的质荷比运行检索软件，在蛋白质理论数据库中进行检索，寻找具有相同肽质量指纹的蛋白质，以达到鉴定蛋白质的目的。

肽质量指纹图谱鉴定蛋白质的精确性依赖于蛋白质数据库中数据的准确性、比对算法以及其检索软件的功能。

目前，已开发建立了许多基于PMF的数据库分析软件，如MS-fit、Peptident、MOWSE、ProfFound和PeptideSearch等。

百泰派克生物科技采用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，提供高效精准的肽质量指纹图谱分析服务技术包裹，可精确鉴定蛋白肽段的分子质量从而实现完整蛋白质的鉴定，欢迎免费咨询。

质谱测肽段
质谱测肽段是通过质谱技术对肽段进行分析鉴定的过程。

肽段指多肽或蛋白质经酶消化后得到的较短的肽链。

质谱测肽段的方法主要有两种：
1. 单一来源的肽段：如果其来源的多肽或蛋白质为已知基因序列、cDNA序列或蛋白质序列的，可以采用肽质量指纹图谱PMF对肽段进行分析鉴定。

PMF技术相对于传统方法具有速度快、高通量的优点。

2. 来源不同的肽段混合物：则需要利用串联质谱（MS/MS）对其进行分析鉴定。

MS/MS通过一级质谱测定可以得到肽段的质量，通过二级质谱对肽段进行解离，产生较小的肽段碎片离子，碎片离子经由检测器分析得到肽段的氨基酸序列信息，从而实现肽段的鉴定。

质谱测肽段在蛋白质分离纯化、蛋白质鉴定和遗传学分析等方面具有广泛的应用。

拓展资料
肽段是由氨基酸组成的短链蛋白质,通过质谱技术可以确定肽段的序列和分子量,以及探索其在生物学、药学和医学中的功能和作用。