基因编辑技术PPT

格式：ppt
大小：10.10 MB
文档页数：124

下载文档原格式

基因编辑技术和原理ppt课件

为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA) 靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
三种不同技术的比较
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业法权益
基因编辑的不足 • 基因编辑是一项新技术，还存在构建复杂和价
格的问题，其脱靶效应限制了其在基因治疗等应用上的发展。

crispr cas9技术课件PPT

8
2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应
2021/3/10
7
CRISPR/技术的前景及优缺点
➢ 3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 ➢ 1.在基因敲除方面具有绝对的优势 ➢ 2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗 ➢ 3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术
2021/3/10
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。
➢ 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
➢ 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2021/3/10
3
CRISPR/cas9作用机理
1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间

基因编辑技术在医学领域的应用培训课件

目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它通过向导RNA将Cas9核酸酶引导到目标基因位点，实现精准的基因编辑。
基因编辑技术的发展历程
基因编辑技术的发展经历了早期的基因敲除技术、ZFNs（锌指核酸酶）和 TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）等阶段，直到近年来CRISPR-Cas9系统的出现，使得基因编辑技术取得了突破性的进展。
02
伦理和法律监管
随着基因编辑技术的发展，伦理和法律监管将逐渐加强，确保技术的安全和合理应用。
03
社会接受度逐渐提高
随着技术的成熟和应用的广泛，社会对基因编辑技
基因编辑技术的基本原理
介绍了CRISPR-Cas9系统的工作机制，以及基因编辑过程中的关键步骤。
生物多样性
基因编辑技术可能对生物多样性产生威胁，因为它可能导致基因库的单一性和脆弱性增加。
法规与监管
法规缺失
目前全球范围内对于基因编辑技术的监管还存在一定的空白和不确定性。
监管难度
由于基因编辑技术的复杂性和快速变化，监管机构面临着监管难度和挑战。
国际合作
加强国际合作和交流，共同制定和完善基因编辑技术的法规和监管体系，以确保技术的安全可控发展。
在医学领域的应用前景
遗传性疾病的治疗
基因编辑技术有望治愈一些遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病等。
癌症治疗
通过编辑癌症细胞的基因，实现精准治疗和个性化治疗。
罕见病治疗
针对罕见病患者，基因编辑技术有望提供有效的治疗方案。
社会对基因编辑技术的态度与接受度
01
公众认知度提高
随着基因编辑技术的普及和宣传，公众对基因编辑技术的认知将逐渐提高。

《基因编辑新技术》课件

• 基因疾病的治疗 • - 临床案例：ADA - S C ID • 癌症治疗方案 • - CA R - T细胞治疗 • - 基因修复及监测
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望

crisprcas基因编辑技术原理与应用ppt课件

为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现原理应用优点缺点发展前景
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
What
01
Clustered regularly interspaced
shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物模型、改良动物品系和研制动物反应器等。

基因编辑技术在医学研究中的应用培训课件

全。
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确保基因疗法药物的安全性和有效性得到科学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得足够数量的治疗用细胞。

基因编辑技术比较CRISPR Cas9,casF,Cpf1 ppt

CRISPR-CPf1作用原理
cas9 / casF /cpF1总结
Part.4
Cpf1/Cas9比较
Cas9/ casF / Cpf1总结
谢谢观看
CRISPR：
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，是成簇的规律间隔的短回文重复序列。右图展示了完整的CRISPR位点的结构。
CRISPR/cas9基因编辑原理
主要内容
crRNA ( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activatingRNA )结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。
CRISPR/cas9、casF、Cpf1 基因编辑技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
➢ 1. CRISPR/cas9基因编辑技术 ➢ 2. CRISPR/casF基因编辑技术 ➢ 3. CRISPR/cpF1基因编辑技术 ➢ 4. cas9 / casF /cpF1总结
CRISPR/cas9的基本原理
Part.1
CRISPR/cas9基因编辑原理
CRISPR/casF基因编辑技术
Part.2
CRISPR/ casF基因编辑技术
原理： casF能切割与crRNA互补的DNA，并且使用单个RuvC活性位点进行pre-crRNA加工和切割。 casF分子量：cas9蛋白的一半 Cas蛋白结构域:HNH、RuvC 向导RNA：crRNA pre-crRNA加工方式：casF蛋白加工 DNA识别区：富含T的PAM 序列（5′TBN 3′，B是G、T或C）优点：分子量小、对PAM区要求低，有利于基于载体向细胞内递送和更广泛的可靶向基因组序列范围

《crisprcas9技术》课件

CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将广泛用于医疗、农业、工业、环保等领域，成为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的新产品、新技术、新应用也将成为未来投资的热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰，影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理

基因编辑技术和原理讲述 ppt课件

连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
PPT课件
9
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
端连接和同源重组修复两条途径。
PPT课件
4
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因敲入。
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
PPT课件
6
基因编辑原理
PPT课件
7
基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术，分别为：人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术；转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like

基因编辑技术课件

Editas宣布的2017年人体实验激动人心之处在于，这有可能是首次体内（in vivo）基因编辑试验。这项研究成功的意义在于，将CRISPR基因编辑“工具”装载到病毒体内，再把病毒注射到患处，CRISPR可以自行对患病部位进行基因改造。那么以后治疗Layla那样的白血病，不用分离T细胞了，直接将改造好的病毒注射到骨髓，就直接将基因异常的骨髓修复了，或者是直接整合目标基因加强其战斗力。这样一来，很多大手术就会变成微创手术，带来的好处是难以估量的。
根据CRISPR/Cas 系统这一特性，将其用于设计人工的核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，用来对我们感兴趣的基因位点进行修饰．三类 CRISPR/Cas 系统中TypeⅡ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一个蛋白．目前，产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶。
利用同源重组机制对基因进行定向失活是为基因功能评估提供信息的有力手段。但是这一技术的应用有几个限制因素，包括遗传工程组件插入目标位点的效率低、筛选过程费时费力、有可能产生不利的突变效应等。
RNAi基因靶向敲除技术给研究者提供了快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法，但是， RNAi的基因敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况，所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中。
第一代人工核酸内切酶：锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。

crisprcas基因编辑技术原理与应用 ppt课件

模式
动物关的基因来用小鼠或其他模型动物建立
相应的疾病模型。研究者可以应用这些
疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病
发生过程;也可用于筛选有效治疗药物,
或通过研究特异的表面分子、信号通路
等开发新的靶向治疗药物等。
17
传统方式
用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操作技术将其移入到早期胚胎(即囊庇)中,将改造后的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾病模型。
利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀
代表着不同的Cas9酶
13
应用
用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程,可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在胚胎干细胞上操作,可用于多生物细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少数大鼠中,任何可进行胚胎操作的物种都能成为基因组工程的目标。
好相比其它编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术好用吗？
怎
怎么用CRISPR/Cas基因编辑技术？
7
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现原理应用优点缺点发展
前景
8
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly

基因编辑技术ppt课件模板

全球范围内的合作与竞争
基因编辑的全球普及
据估计，到2025年，全球基因编辑市场规模将达到113亿美元。
中国在基因编辑领域的迅速崛起
中国的基因编辑研究论文数量在过去五年内增长了180%，位列全球第二。
美国在基因编辑领域的领先地位
美国拥有全球最多的基因编辑专利（占46%）和研究机构（占27%）。
基因编辑技术的伦理争议
全球范围内，有69%的人认为基因编辑技术的使用应该受到严格监管。
基因编辑的社会影响和政策制定
基因编辑的医疗应用根据《Nature Biotechnology》的数据，全球已有30多个国家在临床实验中使用CRISPR技术，为治疗遗传性疾病提供可能。基因编辑的社会伦理问题 2018年一项调查显示，74%的人认为基因编辑应用于胚胎是不道德的，反映出公众对基因编辑的社会伦理担忧。
01.
基因编辑技术的历史发展
20世纪60年代：基因编辑的初步探索
1962年：基因编辑的开端科学家在实验中首次发现可以通过人工手段改变DNA序列，标志着基因编辑技术的诞生。 1970s：限制性内切酶的出现科学家们发现了一种名为限制性内切酶的蛋白质，它可以精确切割 DNA，为基因编辑提供了工具。 1980s：基因克隆技术的发展通过基因克隆技术，科学家们可以大量复制特定的DNA片段，使得基因编辑的研究得以深入。
TALEN技术
基因编辑技术的应用广泛基因编辑技术在农业、生物研究等领域有广泛应用，据统计，2019年全球基因编辑市场规模达到4.7亿美元。 TALEN技术的优势显著 TALEN技术具有精度高、操作简便等优点，被《科学》杂志评为2012年年度十大科技进展之一。
常用的基因编辑技术:ZFN技术

人类基因编辑技术的发展与伦理考量培训ppt

基因编辑技术是指通过修改生物体的基因序列来改变其遗传信息的科技手段。
02
基因编辑技术包括基因敲除、基因敲入、基因修饰等技术，这些技术能够精确地定位和修改生物体的基因组。
基因编辑技术的发展历程
基因编辑技术的起源可以追溯到上个世纪70年代，当时科学家们开始探索如何修改生物体的基因组。
经过几十年的研究和发展，CRISPRCas9系统等基因编辑技术逐渐成熟，并开始应用于人类疾病治疗和农业生产等领域。
对基因编辑技术的安全性进行全面评估是一项巨大的挑战。
伦理考量
对人类基因的编辑涉及到伦理和法律问题，需要谨慎考虑。
如何应对基因编辑技术的风险和挑战
加强技术研发
持续投入研发，提高基因编辑技术的准确性和安全性。
伦理法规制定
制定严格的伦理和法规，规范基因编辑技术的使用。
公众参与和教育
提高公众对基因编辑技术的认识和参与度，加强相关教育和培训
基因编辑技术在农业领域的应用
作物改良
通过基因编辑技术改良作物的抗逆性、产量和品质等性状，提高农业生产效益。
转基因作物
利用基因编辑技术将外源基因导入作物中，培育出具有抗虫、抗病、抗除草剂等性状的转基因作物。
精准育种
通过基因编辑技术对作物进行精准育种，缩短育种周期，提高育种效率。
基因编辑技术的未来发展前景
精准医疗
随着基因编辑技术的不断完善，未来有望实现精准医疗，为患者
提供个性化的治疗方案。
农业可持续发展
基因编辑技术有望为农业可持续发展提供有力支持，提高作物产量和品质，降低环境污染。
伦理与法律监管
随着基因编辑技术的广泛应用，伦理和法律监管问题将逐渐凸显，需要加强相关研究和立法工作。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：Leabharlann 5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ
5ˊ-CTGCA
G-3ˊ
3ˊ-G↑ACGTC-5ˊ
3ˊ-G
+ ACGTC-5ˊ
平端缺口（钝性末端）( SmaⅠ）
5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ 3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ
5ˊ-CCC 3ˊ-GGG
是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。
26
噬菌体生活周期
27
28
3、酵母酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
29
第五节重组DNA技术
30
基本步骤
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
2.来源：原核生物
11
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。
Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没
有多大的实用价值。
Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切
割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
12
4.识别和切割位点：
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达 31
1、制备目的基因
（1）化学合成：已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序
列推导出相应基因DNA碱基序列。目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小
CELLECTIS S.A. NASDAQ
1
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
2
基因组编辑技术简介
Genome Editing
3
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步：按我们的设计来重组DNA
4
第一节基本概念
5
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。
识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。
通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段 5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’
13
① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端）
14
5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：
5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
又称为分子克隆技术或基因工程技术
6
第二节重组DNA技术的发展史
7
基因工程的诞生
1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA
1980年Nobel化学奖
2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年
17
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。（1）5’端标记（2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身
连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而失活，故CIP较为常用。
18
5、末端转移酶催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
24
pBR322质粒载体 ①相对分子质量小，长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。
25
2、噬菌体（bacteriophage,phage)
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
16
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。
可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
耐热DNA聚合酶最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性
克隆位点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
22
3、常用载体质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
23
1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
8
第三节工具酶
9
1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith Daniel Nathans 得到第一个限制酶用限制酶切得
SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
10
1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。
19
第四节重组DNA技术常用载体
20
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
分类：克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外
源DNA片段。表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因
表达产物。
21
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多
+
GGG-3ˊ CCC-5ˊ
切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口
15
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。
大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。
ACG-OH TACTTAA-P