荧光定量PCR办法探针法VS染料法

荧光定量PCR办法探针法VS染料法精⼼整理荧光定量PCR⽅法：探针法VS染料法？荧光定量PCR⼜称qPCR，是⼀项⾮常常见的分⼦⽣物学实验技术。

荧光定量PCR 荧光为基础对核酸进⾏定量分析，其应⽤⾮常⼴泛，可以⽤于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯⽚或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对⽚段的拷贝数（CNV）进⾏分析，对基因进⾏分型等等。

⼤部分研究者主要的应⽤是对基因的表达量进⾏测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct值）。

从理论上说，起始模板量和Ct值密切相关，因此我们通过判读Ct值从⽽对样本进⾏定量。

在进⾏荧光定量PCR时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是⽅法的选择，对最终结果的准确性⾄关重要。

荧光定量PCR从⽅法上来说可以分为染料法和探针法两种。

探针法?染料法⼀、染料法在国内，染料法⼀般采⽤DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使⽤简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使⽤染料法进⾏后续实验。

在染料法荧光定量PCR实验中，染料能够与双链结合，从⽽发光，⽽在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光。

所以，⼀个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈⽐列，且会随扩增产物的增加⽽增加。

但是染料法检测的是体系中的所有双链DNA,因此⼀些⾮特异性扩增或者引物⼆聚体的出现，会极⼤的影响真实结果的准确性。

为此，⼀些⼚商提供ROX作为内部荧光参考标准，⽤来校正背景，但是即便如此，染料法是否只有⼀种。

⼆、TaqMan探针法光探针。

FAM 或Hex扩增时（在延伸阶段），Taq酶的5'-3'链，就有⼀个荧光分⼦形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。

探针法与染料法的最⼤区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于⽬标序列，也就是不受⾮特异性扩增及引物⼆聚体的影响。

除此之外，⼈们还可以利⽤不同探针，在⼀个体系中使⽤不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的⽬的。

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

荧光定量P‎CR中探针‎法与染料法‎的区别：一、荧光定量P‎CR中探针‎法与染料法‎的描述：1.荧光定量P‎CR探针法‎：探针法即除‎了引物外另‎外设置一个‎探针，在探针的两‎端分别带上‎发光集团和‎淬灭集团，这个时候，两个平衡不‎发光，但是当DN‎A通过引物‎合成的时候‎，探针被折断‎，释放出发光‎集团和淬灭‎集团，两个距离较‎远，发光集团产‎生荧光，被机器收集‎到信号，从而检测基‎因的量2、荧光定量P‎CR SYBR Green‎染料法：染料能够与‎双链结合，当PCR扩‎增的时候，染料结合到‎D NA上，从而发光，单个的染料‎不发光，这样就能收‎集到信号，我们可以看‎出，染料法特异‎性不强，只要是双链‎的DNA都‎回结合发光‎。

二、荧光定量P‎CR中探针‎法与染料法‎的优缺点1、探针法通过‎探针可以增‎加反应收集‎信号的特异‎性，只有探针结‎合的片段上‎发生扩增才‎能收集到信‎号，能够用多重‎体系反应的‎方法，能够预测和‎提前进行反‎应条件的优‎化，缺点是要合‎成探针，成本高2、染料法经济‎实惠，可以做溶解‎曲线，分析全部P‎CR产物的‎T M值，缺点就是特‎异性没有探‎针法好【分享】定量pcr‎仪选则宝典‎:各自精彩的‎选择如何选择合‎适的定量PCR仪定‎量P CR仪‎主要由两部‎分组成，一个是PC‎R系统，一个是荧光‎检测系统。

选择定量P‎C R仪的关‎键——由于定量P‎C R必需借‎助样本和标‎准品之间的‎对比来实现‎定量的，对于定量P‎CR系统来‎说，重要的参数‎除了传统P‎CR的温控‎精确性、升降温速度‎等等，更重要的还‎在于样品孔‎之间的均一‎性，以避免微小‎的差别被指‎数级放大。

至于荧光检‎测系统，多色多通道‎检测是当今‎的主流趋势‎——仪器的激发‎通道越多，仪器适用的‎荧光素种类‎越多，仪器适用范‎围就越宽;多通道指可‎同时检测一‎个样品中的‎多种荧光，仪器就可以‎同时检测单‎管内多模版‎或者内标+样品，通道越多，仪器适用范‎围越宽、性能就更强‎大。

荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。

二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。

选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。

至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。

1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。

1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。

随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。

通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。

2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。

探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。

SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。

3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。

反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。

荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。

4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。

例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。

在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。

例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。

总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。

与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。

实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。

qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。

SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。

SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。

这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。

探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。

在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。

在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。

探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。

无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。

首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。

然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。

利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。

实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。

收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光标记的染料法和探针法荧光标记的染料法和探针法，听起来是不是有点晦涩难懂？但其实说白了，这就是两种非常有趣、非常有用的实验方法，专门用来“追踪”和“观察”细胞或者分子里面的神奇世界。

要是用大家能听懂的语言解释，就是这些方法让我们能看到一些平时眼睛看不见的小东西——细胞里发生了什么，某个特定的分子在不在，甚至它们是不是还在忙着做着一些复杂的反应。

就好像你能用一个特殊的眼镜，看清楚别人眼中看不到的东西一样。

首先说到“荧光标记的染料法”，它其实就是利用一些能发光的染料来做标记，这些染料特别神奇，吸收光之后，自己会发出不同颜色的光。

你可以想象这些染料就像是一只会发光的小螃蟹，它们一碰到特定的东西，就会发出五光十色的亮光，瞬间把目标引入了你的视野。

这些染料就像是“指路明灯”，你可以用它们标记细胞的特定区域，或者是细胞里特定的分子，然后利用显微镜什么的观察到它们的样子。

比如说，我们研究一种新的药物效果，怎么知道药物是不是成功作用到细胞了？就可以把药物和一些荧光染料结合在一起，看看药物是不是在细胞里亮了起来。

这样一来，研究人员就能通过“光芒”看到药物的“到达现场”，不再是靠猜和推测了。

荧光染料法有个最大好处，那就是它能让你看得非常清楚，而且时间上也挺灵活，你可以随时观察标记的分子，看看它们是如何随着时间的推移发生变化。

你还能标记不同的东西，用不同颜色的荧光染料，看看它们是怎么“同场竞技”的。

这就像是你在看一场盛大的舞会，荧光染料们就像是舞池里的小明星，每一个都穿着不同颜色的闪亮衣服，光芒四射，想不注意都难。

不过呢，染料法虽然好，但是也有一些“小毛病”。

染料并不是永远稳定的，它们可能会因为实验条件变化，发出的光不稳定，甚至可能“耗尽电力”——就是说发光时间变短或者干脆不发光了。

那时候你可能就需要换一个新染料，或者调整实验条件，调皮的小染料可不好对付呢。

接着说说“探针法”，这个听起来是不是也有点像是间谍电影里的那种秘密武器？其实说白了，探针法就是用一些非常特殊的分子，去“探测”细胞或者分子里的某些东西。

荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。

二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。

选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。

至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。

染料法和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）的优缺点比较一、荧光染料法(SYBR Green)其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。

如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。

优点：1、成本较低，适合大规模的实验。

2、在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。

缺点：1、特异性不是很高。

染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产物。

2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。

3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。

需要更多的时间进行结果分析。

二、寡核苷酸探针(Taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子)，探针通常在5 端和3 端都被标记。

在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。

RT-qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。

使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。

优点：1、更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。

2、不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。

3、由于具有特异性，数据更可靠。

4、数据分析时节省时间。

缺点：1、需要大规模实验时耗费成本高。

2、需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。

总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。