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Illumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina 公司的新一代测序仪Genome Analyzer 最早由Solexa 公司研发，利用其专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator ）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina 公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa ，就是为了促成Genome Analyzer 的商品化。
Genome Analyzer 作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
Genome Analyzer 自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，《《Nature 》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer 完成的。
哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据，Genome Analyzer 已售出约200台，估计是市场占有率最广的。
前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer 。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad 研究院拥有47台Illumina 测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina ，看中的无疑是Genome Analyzer 的高性价比。
上个月，Illumina 将Genome Analyzer II 升级到Genome Analyzer IIx ，距年底实现单次运行获得95 GB 数据的宏伟目标又近了一步。
二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。
下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。
1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。
其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。
然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。
这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。
优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。
（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。
（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。
（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。
缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。
（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。
（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。
2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。
三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。
该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。
这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。
优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。
（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。
碱基测序技术原理及其进展摘要：自1953年，剑桥大学科学家弗朗西斯.克里克(Francis crick)和博士詹姆斯华生(Jamers waston)发现DNA双螺旋结构以来，已经走过近60年。
在这期间，有关DNA的研究如火如荼。
DNA碱基排列顺序中存在生物的遗传信息，为了的到DNA碱基顺序，研究者先后研发出不同的测序技术获得碱基信息。
从1953年至今，碱基测序技术可以划分为三代，下面主要介绍第一代、第二代测序原理及其存在的优劣。
关键词：cDNA sanger测序法焦磷酸测序法第二代测序法1.1977第一代—sanger测序法及Maxam-Gilbert化学裂解法。
1.1sanger测序法1977年英国的F.sanger设计了 Sanger双脱氧链终止法[1]，其原理：双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’, 3’-双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，将延伸的DNA 链特异性地终止。
其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA 聚合酶。
共分四组，每组按一定比例加入一种ddNTP，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，再通过电泳分离，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。
由于放射性同位素标记对实验人员的身体有害及准确性低等原因，又对sanger测序法进行了技术上的改进，采用荧光素标记、毛细管电泳的全自动测序技术。
1.2 Maxam-Gilbert化学裂解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法—Gilbert化学裂解法原理：将待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核苷酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样(Lane- by-lane)的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影技术，即可读出目的DNA的碱基序列。
第二代测序技术的发展生物的遗传信息都储存在其DNA中，解读其DNA的核苷酸序列，对于揭示探索生命奥秘、治疗疾病，以及对整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用，并具有广阔的应用前景。
基因组重测序是相对于全基因组de novo 测序而言的，是借助于第二代测序技术和计算机分析技术，迅速发展起来的，并被生物学家广泛应用的一种测序方法。
第二代测序技术，又称新一代测序技术（next generation sequencing），相对于基于Sanger 法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化的第一代测序技术而得名的。
第二代测序技术依据不同的测序原理，主要包括三个平台：Illumina公司的Solexa Genome Analyzer 测序平台、ABI公司的Solid 平台、罗氏454公司的GSFLX测序平台，虽然它们的测序原理不完全相同，但共同的特点是都不需要传统的克隆步骤，实现了更高的通量。
与第一代测序技术相比，第二代测序技术不仅保持了高的准确度，而且大大减低了测序成本并极大地提高了测序速度。
1）罗氏454公司的GSFLX测序平台454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台，它的原理如下：①待测DNA文库的构建把带测序列用喷雾法（nebulization）打断成300—800bp的小片段并在两段加上不同的接头，或者将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增，链接载体，构建单链DNA（ssDNA）文库。
②Emulsion PCR 将这些ssDNA与水油膜包被的直径大约28um的磁珠连在一起孵育、退火，由于磁珠表明含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA 会特异地连接到磁珠上。
同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增，扩增产物扔可以结合到磁珠上。
反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。
经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需要的模板量。
一、ABI的solid liiumina的SOLEX 和ROCHE/454的GX FLX，三种平台在技术特点上有什么异同？面对三种平台，该如何选择呢？简而言之：Roche 454是焦磷酸测序；Illunima Solexa是合成法测序；ABI SOLiD是连接法测序。
就读长来看：Roche 454 > Illunima Solexa > ABI SOLiD。
就Reads数来看：ABI SOLiD > Illunima Solexa > Roche 454。
就应用来看：Roche 454读长最长，便于拼接，因此在de novo测序方面有很大优势；ABI SOLiD虽然读长很短，但是Reads数最多，而且ABI独有的双色球编码技术，使得每个碱基都会被读取两遍，准确率很高，因此ABI SOLiD在检测SNP、转录组测序、ChIP-Seq等方面很有优势；Illunima Solexa的读长和Reads数均位于中间，比较适合于基因组重测序。
而在实际应用中，由于Roche 454成本太高，因此Illunima Solexa 也被较多的应用于de novo测序。
二、关于生物芯片和二代测序1：现在二代测序很火，有一种取代芯片的趋势，我想知道，生物芯片和二代测序各自的优缺点？2：什么样的研究，使用芯片更好?什么样的测序更好？3：关于不同的测序平台，测的长度不同，有什么样区别？4：什么是数字表达谱？microarray和NGS都是高通量的基因组学研究手段，两者还是有较显著的差异。
首先，根本机制不同，Microarray本质上是核酸杂交；NGS本质上是PCR。
其次，microarray是一个封闭的系统，不可能检测到探针没有覆盖到的那部分信息；而NGS是一个开放的系统，来什么，测什么。
（1）microarray不能发现新序列，而NGS可以发现一些以前没有检测到的基因。
（2）由于NGS本质上还是PCR，在建库的过程中样本被扩增上千倍，因此样本中基因的量的线性关系会有所偏差。
二代测序4个平台比较illumina Roche illumina MiSeq&HiSeq1000和Roche454 Junior&FLX 性能比较表Illumina MiSeq Roche 454 Junior Illumina HiSeq1000 Roche GS FLX 通量最高通量的个人化测序仪，自动完成0.035G 数据量全球最高通量的二代测序: 0.45G碱基数据量;从簇生成到测序到数据一级分析和300G的数据量;二级分析, 每此运行可产出300M-15 Gb数据读长 2x300bp 400 bp 2x100bp 450bp运行费用 300-1000美元/G的数据量 70,000美元,G的数据量 60美元/G的数据量 20,000 美元/G的数据量数据准确, Illumina SBS 测序化学原理, Q20数据质量(如果无重复序, Illumina SBS 测序化学原理, Q20数据质量(如果性是二代测序技术中最被广泛列) 是二代测序技术中最被广泛无重复序列) 证明和认同的(市场份额和证明和认同的(市场份额和发表文章数量均远超过竞争, 焦磷酸测序存在发表文章数量均远超过竞争, 焦磷酸测序存在对手) homopolymer无法正确读取对手) homopolymer无法, 数据质量不受, 数据质量不受正确读取Homopolymeric regions 影响 Homopolymeric regions 影响, >Q20 数据质量( >80%数据, >Q20 数据质量 (>80%数据为为Q30) Q30)实验周期整个实验流程需要数天时间，包括: 文库制备:1.5小时Netera快速方法整个实验流程需要数天时提供最快的二代测序的实验流程，最, 文库制备:1天，且需要大量和1天的TruSeq标准方法。
间，包括:的手工操作 , 文库制备:1天，且快可在8小时内完成从DNA样本建库, ePCR+ Enrichment: 在主机外8.5天产生300G数据。
二代测序技术比较Illumina_、454_、ABI_测序仪比较.docIllumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa，就是为了促成Genome Analyzer的商品化。
Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
Genome Analyzer自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，《Nature》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer完成的。
哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据，Genome Analyzer已售出约200台，估计是市场占有率最广的。
前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad研究院拥有47台Illumina测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina，看中的无疑是Genome Analyzer的高性价比。
上个月，Illumina将Genome Analyzer II升级到Genome Analyzer IIx，距年底实现单次运行获得95 GB数据的宏伟目标又近了一步。
Genome Analyzer IIx有两个核心特征：其一是更大的试剂冷却器，支持超过100个测序循环，进一步提升了系统的易用性和自动化；其二是全新的流动池支架，让每轮运行所得的高质量数据增加20%。
依靠系统软件和试剂的改进，Genome Analyzer IIx现在能够支持100 bp以上的配对末端读长，并在每次运行中产生超过20 GB的高质量数据。
Genome Analyzer技术的基本原理：1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。
2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。
另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥(bridge) “。
反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。
DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。
3. 测序Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。
加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。
这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。
此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。
之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。
如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。
这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。
目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。
读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。
4. 数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。
Genome Analyzer系统之所以如此畅销，关键在于其技术上的优势。
1. 可扩展的超高通量Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。
这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。
到今年底，通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。
2. 需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。
这也是很多研究人员所考虑的因素。
3. 简单、快速、自动化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。
即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。
制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。
Cluster Station可以说是Genome Analyzer的核心。
由独立软件控制的自动生成DNA 簇的过程可以在5小时之内（30分钟手工操作）完成。
这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。
快速的实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化步移降低了项目的时间和费用。
4. 新颖的测序化学技术Genome Analyzer通过合成测序来支持大规模并行测序。
利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。
由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的误差。
5. 单个或配对末端支持Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。
文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间。
制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6个小时，只有3个小时需要手工操作。
2×50个碱基或更长的读长增加了比对基因组的能力，并拓展了在其他方面的应用。
然而，精明的用户更看重的是性价比，这也是他们选择Illumina的重要原因。
Illumina的售价约为45万美元，低于454 GS FLX的50万和SOLiD系统的59万（以上皆为美国的售价）。
此外，运行成本也是一个关键因素。
美国凤凰城翻译基因组学研究院（TGen）的主管David Duggan 曾表示，当年购买新一代测序仪时，每次运行的费用就成为他下决定的主要因素。
他最终选择了Illumina Genome Analyzer，因为每轮的运行费用为3000-4000美元（2007年的数据），较为合理，而其他测序仪可能更高。
当然，他也综合考虑了通量、运行时间和样品量。
弗吉尼亚联邦大学的高原（音译）博士认为：“Genome Analyzer的操作费用、易用性和可扩展性让我实现了大规模基因组实验。
现在，我的小型实验室正在进行过去只能在大型基因组中心才能完成的实验。
低样品需求、简单的流程、高质量的数据以及应用灵活性让Illumina Genome Analyzer从其他高通量测序技术中脱颖而出。
”ROCH-454 测序仪454公司可谓新一代测序技术的奠基人。
2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
一年后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
去年10月，全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件的补充，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg 就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
就这样，乳液PCR终于诞生了。
之后，454生命科学公司用新一代测序仪对DNA双螺旋结构的发明者James Watson进行了基因组测序。
第一份个人基因组图谱的绘制只用了两年时间，花费不到100万美元。
虽然现在看来这并不算什么，但就当时而言，它相对于人类基因组计划已是质的飞跃。
GS FLX系统的工作流程GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段= 一个磁珠= 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。
大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp 的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。
短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。
2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。
接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。
具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。
3）一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。
每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。
磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。
整个片段文库的扩增平行进行。
对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。
