土壤微生物量碳氮测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

土壤微生物量的测定一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）1、试剂配制（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。

方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1]（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。

（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。

注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。

注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。

（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。

2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。

首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。

另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。

其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。

浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。

熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。

微生物量碳、氮的转换系数为0.45。

土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。

10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。

土壤微生物量氮的测定方法1.试剂配制：(1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。

均匀混合后研细,贮于瓶中。

(2)密度为1.84浓硫酸。

(3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定容至1L。

(4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。

（按体积比100:2加入混合指示剂）(5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。

(6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定之。

(7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1L。

(8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。

再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。

将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。

2.试验步骤：。

（1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。

取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。

干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。

按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。

土壤微生物碳、氮测定方法—熏蒸提取法1、提取液的制备：仪器：抽气皿、无醇氯仿，抽气机，大铝盒，分析天平，小三角瓶（50ml）、大塑料瓶（250ml），三角瓶（100ml）。

试剂的制备：无醇氯仿（提取方法：用1N硫酸溶液与氯仿按体积比2：1于分液漏斗中震荡混匀，静置分离，共做三次，再用去离子水代替硫酸与氯仿2：1混匀，震荡分离，共三次，将提纯的放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠保存。

）分析步骤：1、称取相当于干土12.5g的鲜土于大铝盒中，在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，放几张小纸片以便于观察沸腾，放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机，盖上黑布，置于阴暗处（25℃）熏蒸24小时，到时间后，取回小烧杯，后反复抽真空3~5次，排除氯仿。

2、另称取一批同等重量的土放入干燥器中作未熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。

3.将上述步骤中的两批土样转移到大塑料瓶中（此操作应尽快进行）每个瓶内50ml0.5M硫酸钾溶液，盖紧瓶塞，震荡30分钟，取出，用定量滤纸过滤到100ml 大三角瓶中，应立即测定，如果不立即测定，可用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在4℃的冰箱中24小时。

微生物氮的测定—消煮，碱化蒸馏法仪器：定氮仪，烘箱，开氏瓶（50ml），移液管（2，5，25ml），小漏斗，小三角瓶（150ml）试剂的制备：去离子水，浓硫酸（化学纯），硼酸指示剂，10M氢氧化钠（化学纯），硫酸铜溶液。

分析步骤：吸取上述步骤中的过滤液25ml放入到开氏瓶中，加入2ml浓硫酸（固定滤液中的氨），放入到烘箱中在60~70℃烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右滤液，取出加入3ml浓硫酸和1ml硫酸铜溶液，放上小漏斗在电炉上消煮，消至瓶内颜色呈天蓝色（半小时左右）为止，取下冷却，同时用0.5M硫酸钾溶液25ml 代替滤液做空白。

用去离子水洗净小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml10M氢氧化钠溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接受蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏，蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道、用1/2硫酸标液（0.01）滴定馏出液，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录数据。

微生物碳氮磷测定(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制二、微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph 至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。

10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。

微生物量碳氮测定方法微生物量、碳氮测定方法是研究微生物数量和代谢活性的关键手段，可用于土壤、水体和生物体等环境中的微生物研究。

常用的微生物量、碳氮测定方法包括显微镜计数法、流式细胞术、气体产量法、碳氮比测定法等。

下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。

一、显微镜计数法显微镜计数法通过显微镜观察和计数微生物的数量来测定微生物量。

其原理是将样品置于显微镜下，在显微镜下观察样品中的微生物数量，并进行计数。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中微生物的数量。

显微镜计数法的操作步骤如下：1.获取样本并制备薄片。

根据需要采集样本，并将样本制备成薄片或涂片。

可以使用高温固定、化学固定或热固定等方法固定样本。

2.显微镜观察和计数。

将固定的样本放入显微镜下，通过放大镜头观察样本中的微生物，并进行计数。

为了避免重复计数和遗漏计数，可以使用方格计数器。

3.根据计数结果计算微生物量。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中的微生物数量。

通常计算结果以每克（或每升）样品中的微生物数量表示。

二、流式细胞术流式细胞术是用于计数、分类和分析微生物的一种高通量、高精读的方法。

其原理是将样品中的微生物通过细胞色素或抗原标记，通过流式细胞仪进行激光扫描，扫描到的细胞信号通过计算机进行分析，从而得到微生物的数量、大小和类型等信息。

流式细胞术的操作步骤如下：1.准备样品和染色。

根据需要采集样本，并给样本进行染色。

染色可以使用细胞色素或抗原标记法，将需要测定的微生物区分出来。

2.流式细胞仪扫描。

将染色的样品装入流式细胞仪中，通过激光扫描仪器扫描染色的细胞，并记录扫描到的细胞信号。

3.数据分析。

通过计算机分析扫描到的细胞信号，得到微生物的数量、大小和类型等信息。

三、气体产量法气体产量法是通过测定微生物代谢过程中产生的气体来间接测定微生物的数量和代谢活性。

常用的气体产量法有氧呼吸测定法和甲烷产量测定法。

气体产量法的操作步骤如下：1.准备培养基和反应器。