镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响
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诱导子制备参照兰文智 [ 3 ] 和 L iu [ 4 ]的方法进 行 。将活化的镰刀菌接种于马铃薯 - 葡萄糖培养液 中 , 25℃ ±0. 1℃, 110 r·m in- 1振荡培养 ,黑暗条件 下培养一个星期 。收获的菌丝用于制备真菌诱导 子。
用 100目筛收集菌丝体 ,用蒸馏水反复冲洗 ,准 确称取收获的湿菌体 40 g转移至烧杯 ,加蒸馏水约 500 mL ,于超声波细胞破碎仪进行超声破碎至匀 浆 ,然后用 1 mo l·L - 1的盐酸调 pH为 2. 0, 121℃灭 菌 1 h, 减压抽滤 , 滤液用蒸馏水定容至 500 mL , 121℃条件下灭菌 20 m in,调 pH 为 5. 8,得到诱导 子 , 4℃保存备用 。使用时 ,直接将诱导子加入无激 素的 M S培养基中 , 诱导子的加入量按糖含量计算 , 单位为 m g GE /L ( glucose equivalent) ,诱导子糖含量 的测定采用苯酚 - 硫酸法 [ 5 ] 。镰刀菌诱导子糖含 量为 1070 ±30 mg GE /L。 1. 3 诱导子对薯蓣皂素合成与积累的影响 1. 3. 1 不同浓度诱导子对薯蓣皂素合成的影响
一般认为细胞内可溶性蛋白质中大多是一些调 节细胞内代谢的酶类 。实验中出现图 5趋势的原因 可能是早期诱导子的加入暂时抑制了细胞的合成代 谢 ,所以蛋白质含量低 ,之后又由于启动和加强了次 生代谢等特定代谢途径 ,使得蛋白质的含量又上升 。
实验中真菌诱导子可能诱导了植物生理生化反 应发生变化 ,促进了植物保护性酶活性的升高 ,从而 促进了薯蓣皂素含量的提高 ,其内在的分子机理还 有待进一步的研究与探讨 。
添加最佳浓度的镰刀菌诱导子和桔青霉诱导子 至培养基 ,盾叶薯蕷培养物接种后 ,每隔 7 d取一次 样 ,测定薯蓣皂素含量 。 1. 3. 3 薯蓣皂素含量的测定方法
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
参照袁庆华 [ 7 ]和陈艳乐 [ 8 ]方法进行 ,以每 m in 每 g鲜重盾叶薯蓣培养物样品 OD 值变化 0. 01 所 需的酶量为一个酶活单位 。 1. 5 超氧化物歧化酶 ( SOD )活性测定
按照 Stewart和 B ew ley[ 9 ]的方法进行 ,比活力以 每 mg蛋白的酶单位表示 。 1. 6 可溶性蛋白的测定
按照 B radford方法进行 [ 10 ] ,蛋白含量以每 g鲜 重的 mg数表示 。
2 结果与分析 2. 1 诱导子对薯蓣皂素积累的影响 2. 1. 1诱导子对盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂素积累的 影响
不同浓度诱导子处理对盾叶薯蕷培养物中薯蓣 皂素合成的影响结果如图 1。由图 1 知 ,随着培养 基中诱导子的糖含量的增加 ,诱导子对薯蓣皂素的 合成与积累促进作用逐步增强 ,镰刀菌诱导子体积 分数 30 m l·L - 1即培养基中诱导子的糖含量达到 30 mg GE /L 时 ,其促进薯蓣皂素合成与积累效果最 佳 ,高于此浓度则表现出一定程度的抑制作用 。
图 2 30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯 蓣皂素含量变化的时间进程
2. 2 镰刀菌诱导子处理对盾叶薯蓣植株中多酚氧 化酶活性的影响
从图 3可以看出 , PPO 活性在镰刀菌诱导子处 理后第 35 d 时达到最高值 ,随后 PPO 活性逐步减 弱 。这可能由于随着培养时间的延长 ,培养基中养 分逐渐消耗 ,酚类等次生物质积累 ,因而 PPO 活性 随之增强 。经过诱导子处理的材料 , PPO 活性基本 高于对照 ,说明镰刀菌诱导子处理除了能刺激薯蓣 皂素积累外 ,还能促进具有防御能力的酶活性的提 高。
酚类是细胞受到外界胁迫时所产生的一种防御 性次生代谢产物 ,而酚类物质的过多积累会对细胞 本身造成伤害 。 PPO 通常被认为是一种典型的酚 类物质清除剂 , 它可将酚类物质转化为醌类 , 从而 减轻酚类对细胞的伤害 。近年来在一些研究中发现 植物受生物胁迫的防御反应中 PPO 的活性往往增 强 [ 13, 14 ] 。实验中添加了镰刀菌诱导子的盾叶薯蓣 培养物 PPO 活性要高于对照 。
图 4 诱导子处理后盾叶薯蓣培养物 SOD 活性变化时间进 程
2. 4 镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蓣培养物可溶性 蛋白质含量变化的时间进程
镰刀菌诱导子处理后 ,盾叶薯蓣培养物可溶性 蛋白总量明显高于对照 。诱导子处理后的前 2个星 期可溶性蛋白含量变化不大 ,甚至在第 3 个星期出 现了降低的现象 ,在培养的第 28 d蛋白质含量又提 高。
SOD是细胞内清除活性氧系统中的重要酶 , 能 有效地阻止 O2 - 和 H2 O2 在植物体内积累 ,使细胞 内自由基维持在较低水平上 ,防止自由基对细胞的 伤害 。当受到真菌诱导子胁迫时 ,植物体内会产生 大量自由基 ,而影响了体内抗氧化机制 ,此时植物体 会通过 SOD 等保护酶类的活性改变来清除这些对 机体有害的自由基 [ 15 ] 。因此 , 在胁迫的早期 SOD 活性提高 ,但到了后期 SOD 活性变化不大 ,可能是 由于植物已经适应环境变化的缘故 。
参考文献
镰刀菌诱导子以 0、5、10、20、30、40 及 50 m l· L - 1 7种体积分数添加至培养基 (mL /L 表示每升培 养基中添加诱导子粗提液的体积 ) 。接种培养 4个 星期时 ,测定盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素的含量 。 1. 3. 2 诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素含 量变化的时间进程
植物 对 诱 导 子 的 反 应 速 度 也 是 有 差 异 的 , M ukundan和 H jortso 的 结果指 出 , 孔 雀 草 ( Tagetes pa tu la)发根中加入诱导子 30 m in 后 , BB TOAc ( ace2 toxybutinylbithiophene)的含量达到干重的 0. 089% ,
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氨基酸和生物资源
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子对 SOD 活性有一定的影响 ,使它的活性维持在较 高水平 ,有利于其次生代谢物的合成 。
真菌诱导子 ( fungal elicitors)是来源于真菌的一 种特定化学信号 ,在植物与真菌的相互作用中 ,能快 速 、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达 , 改变次生代谢途径和强度 ,定向诱导特定次生物质 的合成 。利用诱导子处理促进植物次生代谢产物的 合成与积累 ,近年来一直是植物次生代谢领域普遍 重视的新方法 。镰刀菌是植物根腐病病原菌之一 , 常被用作制作真菌诱导子 。镰刀菌诱导子可使长春 质碱的含量增加近 3倍 [ 2 ] 。迄今 ,尚未见有关应用 真菌诱导子调控薯蕷皂素合成的研究文献报道 。
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刘 娟等 : 镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响
将新鲜盾叶薯蓣培养物烘干至恒质量 ,碎成粉 末 ,过 100目筛 ,称取 200 mg,加 5 mL 甲醇 ,超声浸 提 ,用本实验室建立的薯蕷皂素酶联免疫专利检测 方法 [ 6 ]测定薯蓣皂素含量 。 1. 4 多酚氧化酶 ( PPO )活性测定
关键词 :真菌诱导子 ;薯蓣皂素 ;多酚氧化酶 ;超氧化物歧化酶
中图分类号 : Q94
文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 8376 (2008) 02 - 0001 - 04
薯蓣皂素 ( diosgenin,薯蓣皂苷配基 ,俗称皂素 ) 是合成甾体激素类药物的理想原料 。大多数薯蕷属 植物根状茎中含有薯蕷皂素 ,其中单株最高含量高 达 16. 15% [ 1 ] , 为 我 国 特 有 种 盾 叶 薯 蓣 ( D ioscorea zing iberensis C. H. W right) 。盾叶薯蓣是世界上最 重要的甾体激素类药源植物 。
氨基酸和生物资源 2008, 30 (2) : 1～4 Am ino A cids & B iotic R esou rces
镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响
刘 娟 1 ,陈 路 1 ,毛群星 2 ,李家儒 1
(1. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 , 武汉 430072; 2. 江汉大学图书馆 ,武汉 430056)
图 3 诱导子处理后盾叶薯蓣培养物中 PPO 活性变化的时 间进程
图 1 不同体积分数诱导子对盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂素 含量的影响
2. 1. 2诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素含 量变化的时间进程
30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蕷培养 物中薯蓣皂素含量变化的时间进程如图 2。由图 2 知 ,盾叶薯蕷培养物经 30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处 理后第 14 d,薯蓣皂素含量开始提高 , 28 d时达到最 大值 ,直至培养的第 35 d仍维持较高水平 。
本文探讨了镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养 物中薯蓣皂素合成的影响及一些相关的生理生化作 用。
1 材料和方法 1. 1 盾叶薯源自离体培养物的培养盾叶薯蓣离体培养物为本实验室培养的丛生 芽 ,接种在含有 0. 25 g·L - 1 6 - BA 的 M S固体培养 基上 , 25℃ ±0. 1℃,每 28 d继代一次 ,每天光照 12 h。 1. 2 诱导子制备
图 5 盾叶薯蓣培养物可溶性蛋白质含量变化的时间进程
此时对照中的含量为 0. 065 % , 48 h后 BBTOAc含 量达到对照的两倍 ,随后随着时间的延长 , BBTOAc 的含量下降 [ 12 ] 。一般来说 ,加入诱导子后 ,次生代 谢产物的含量开始提高 ,但一定时间后 ,次生代谢产 物的量反而下降 。本实验中 ,镰刀菌诱导子在添加 后的第 35 d使皂素含量达到最高 。
收稿日期 : 2008 - 04 - 01 作者简介 :刘娟 ,女 (1981 - ) ,硕士生 ,现从事植物生理生化研究 3 通讯作者 : E - mail: jrli@whu. edu. cn; 基金项目 :国家自然科学基金项目资助 (30240078, 30370152)
用 100目筛收集菌丝体 ,用蒸馏水反复冲洗 ,准 确称取收获的湿菌体 40 g转移至烧杯 ,加蒸馏水约 500 mL ,于超声波细胞破碎仪进行超声破碎至匀 浆 ,然后用 1 mo l·L - 1的盐酸调 pH为 2. 0, 121℃灭 菌 1 h, 减压抽滤 , 滤液用蒸馏水定容至 500 mL , 121℃条件下灭菌 20 m in,调 pH 为 5. 8,得到诱导 子 , 4℃保存备用 。使用时 ,直接将诱导子加入无激 素的 M S培养基中 , 诱导子的加入量按糖含量计算 , 单位为 m g GE /L ( glucose equivalent) ,诱导子糖含量 的测定采用苯酚 - 硫酸法 [ 5 ] 。镰刀菌诱导子糖含 量为 1070 ±30 mg GE /L。 1. 3 诱导子对薯蓣皂素合成与积累的影响 1. 3. 1 不同浓度诱导子对薯蓣皂素合成的影响
一般认为细胞内可溶性蛋白质中大多是一些调 节细胞内代谢的酶类 。实验中出现图 5趋势的原因 可能是早期诱导子的加入暂时抑制了细胞的合成代 谢 ,所以蛋白质含量低 ,之后又由于启动和加强了次 生代谢等特定代谢途径 ,使得蛋白质的含量又上升 。
实验中真菌诱导子可能诱导了植物生理生化反 应发生变化 ,促进了植物保护性酶活性的升高 ,从而 促进了薯蓣皂素含量的提高 ,其内在的分子机理还 有待进一步的研究与探讨 。
添加最佳浓度的镰刀菌诱导子和桔青霉诱导子 至培养基 ,盾叶薯蕷培养物接种后 ,每隔 7 d取一次 样 ,测定薯蓣皂素含量 。 1. 3. 3 薯蓣皂素含量的测定方法
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
参照袁庆华 [ 7 ]和陈艳乐 [ 8 ]方法进行 ,以每 m in 每 g鲜重盾叶薯蓣培养物样品 OD 值变化 0. 01 所 需的酶量为一个酶活单位 。 1. 5 超氧化物歧化酶 ( SOD )活性测定
按照 Stewart和 B ew ley[ 9 ]的方法进行 ,比活力以 每 mg蛋白的酶单位表示 。 1. 6 可溶性蛋白的测定
按照 B radford方法进行 [ 10 ] ,蛋白含量以每 g鲜 重的 mg数表示 。
2 结果与分析 2. 1 诱导子对薯蓣皂素积累的影响 2. 1. 1诱导子对盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂素积累的 影响
不同浓度诱导子处理对盾叶薯蕷培养物中薯蓣 皂素合成的影响结果如图 1。由图 1 知 ,随着培养 基中诱导子的糖含量的增加 ,诱导子对薯蓣皂素的 合成与积累促进作用逐步增强 ,镰刀菌诱导子体积 分数 30 m l·L - 1即培养基中诱导子的糖含量达到 30 mg GE /L 时 ,其促进薯蓣皂素合成与积累效果最 佳 ,高于此浓度则表现出一定程度的抑制作用 。
图 2 30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯 蓣皂素含量变化的时间进程
2. 2 镰刀菌诱导子处理对盾叶薯蓣植株中多酚氧 化酶活性的影响
从图 3可以看出 , PPO 活性在镰刀菌诱导子处 理后第 35 d 时达到最高值 ,随后 PPO 活性逐步减 弱 。这可能由于随着培养时间的延长 ,培养基中养 分逐渐消耗 ,酚类等次生物质积累 ,因而 PPO 活性 随之增强 。经过诱导子处理的材料 , PPO 活性基本 高于对照 ,说明镰刀菌诱导子处理除了能刺激薯蓣 皂素积累外 ,还能促进具有防御能力的酶活性的提 高。
酚类是细胞受到外界胁迫时所产生的一种防御 性次生代谢产物 ,而酚类物质的过多积累会对细胞 本身造成伤害 。 PPO 通常被认为是一种典型的酚 类物质清除剂 , 它可将酚类物质转化为醌类 , 从而 减轻酚类对细胞的伤害 。近年来在一些研究中发现 植物受生物胁迫的防御反应中 PPO 的活性往往增 强 [ 13, 14 ] 。实验中添加了镰刀菌诱导子的盾叶薯蓣 培养物 PPO 活性要高于对照 。
图 4 诱导子处理后盾叶薯蓣培养物 SOD 活性变化时间进 程
2. 4 镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蓣培养物可溶性 蛋白质含量变化的时间进程
镰刀菌诱导子处理后 ,盾叶薯蓣培养物可溶性 蛋白总量明显高于对照 。诱导子处理后的前 2个星 期可溶性蛋白含量变化不大 ,甚至在第 3 个星期出 现了降低的现象 ,在培养的第 28 d蛋白质含量又提 高。
SOD是细胞内清除活性氧系统中的重要酶 , 能 有效地阻止 O2 - 和 H2 O2 在植物体内积累 ,使细胞 内自由基维持在较低水平上 ,防止自由基对细胞的 伤害 。当受到真菌诱导子胁迫时 ,植物体内会产生 大量自由基 ,而影响了体内抗氧化机制 ,此时植物体 会通过 SOD 等保护酶类的活性改变来清除这些对 机体有害的自由基 [ 15 ] 。因此 , 在胁迫的早期 SOD 活性提高 ,但到了后期 SOD 活性变化不大 ,可能是 由于植物已经适应环境变化的缘故 。
参考文献
镰刀菌诱导子以 0、5、10、20、30、40 及 50 m l· L - 1 7种体积分数添加至培养基 (mL /L 表示每升培 养基中添加诱导子粗提液的体积 ) 。接种培养 4个 星期时 ,测定盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素的含量 。 1. 3. 2 诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素含 量变化的时间进程
植物 对 诱 导 子 的 反 应 速 度 也 是 有 差 异 的 , M ukundan和 H jortso 的 结果指 出 , 孔 雀 草 ( Tagetes pa tu la)发根中加入诱导子 30 m in 后 , BB TOAc ( ace2 toxybutinylbithiophene)的含量达到干重的 0. 089% ,
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
氨基酸和生物资源
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子对 SOD 活性有一定的影响 ,使它的活性维持在较 高水平 ,有利于其次生代谢物的合成 。
真菌诱导子 ( fungal elicitors)是来源于真菌的一 种特定化学信号 ,在植物与真菌的相互作用中 ,能快 速 、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达 , 改变次生代谢途径和强度 ,定向诱导特定次生物质 的合成 。利用诱导子处理促进植物次生代谢产物的 合成与积累 ,近年来一直是植物次生代谢领域普遍 重视的新方法 。镰刀菌是植物根腐病病原菌之一 , 常被用作制作真菌诱导子 。镰刀菌诱导子可使长春 质碱的含量增加近 3倍 [ 2 ] 。迄今 ,尚未见有关应用 真菌诱导子调控薯蕷皂素合成的研究文献报道 。
·2·
刘 娟等 : 镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响
将新鲜盾叶薯蓣培养物烘干至恒质量 ,碎成粉 末 ,过 100目筛 ,称取 200 mg,加 5 mL 甲醇 ,超声浸 提 ,用本实验室建立的薯蕷皂素酶联免疫专利检测 方法 [ 6 ]测定薯蓣皂素含量 。 1. 4 多酚氧化酶 ( PPO )活性测定
关键词 :真菌诱导子 ;薯蓣皂素 ;多酚氧化酶 ;超氧化物歧化酶
中图分类号 : Q94
文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 8376 (2008) 02 - 0001 - 04
薯蓣皂素 ( diosgenin,薯蓣皂苷配基 ,俗称皂素 ) 是合成甾体激素类药物的理想原料 。大多数薯蕷属 植物根状茎中含有薯蕷皂素 ,其中单株最高含量高 达 16. 15% [ 1 ] , 为 我 国 特 有 种 盾 叶 薯 蓣 ( D ioscorea zing iberensis C. H. W right) 。盾叶薯蓣是世界上最 重要的甾体激素类药源植物 。
氨基酸和生物资源 2008, 30 (2) : 1～4 Am ino A cids & B iotic R esou rces
镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响
刘 娟 1 ,陈 路 1 ,毛群星 2 ,李家儒 1
(1. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 , 武汉 430072; 2. 江汉大学图书馆 ,武汉 430056)
图 3 诱导子处理后盾叶薯蓣培养物中 PPO 活性变化的时 间进程
图 1 不同体积分数诱导子对盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂素 含量的影响
2. 1. 2诱导子处理后盾叶薯蕷培养物中薯蓣皂素含 量变化的时间进程
30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处理后盾叶薯蕷培养 物中薯蓣皂素含量变化的时间进程如图 2。由图 2 知 ,盾叶薯蕷培养物经 30 m l·L - 1镰刀菌诱导子处 理后第 14 d,薯蓣皂素含量开始提高 , 28 d时达到最 大值 ,直至培养的第 35 d仍维持较高水平 。
本文探讨了镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养 物中薯蓣皂素合成的影响及一些相关的生理生化作 用。
1 材料和方法 1. 1 盾叶薯源自离体培养物的培养盾叶薯蓣离体培养物为本实验室培养的丛生 芽 ,接种在含有 0. 25 g·L - 1 6 - BA 的 M S固体培养 基上 , 25℃ ±0. 1℃,每 28 d继代一次 ,每天光照 12 h。 1. 2 诱导子制备
图 5 盾叶薯蓣培养物可溶性蛋白质含量变化的时间进程
此时对照中的含量为 0. 065 % , 48 h后 BBTOAc含 量达到对照的两倍 ,随后随着时间的延长 , BBTOAc 的含量下降 [ 12 ] 。一般来说 ,加入诱导子后 ,次生代 谢产物的含量开始提高 ,但一定时间后 ,次生代谢产 物的量反而下降 。本实验中 ,镰刀菌诱导子在添加 后的第 35 d使皂素含量达到最高 。
收稿日期 : 2008 - 04 - 01 作者简介 :刘娟 ,女 (1981 - ) ,硕士生 ,现从事植物生理生化研究 3 通讯作者 : E - mail: jrli@whu. edu. cn; 基金项目 :国家自然科学基金项目资助 (30240078, 30370152)
