山羊卵母细胞体外培养体系及冻存后体外培养的研究
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庆 大霉素 的生理盐 水洗净后进行体外 培养 。 ｍ Ｏ ａ 进行体外培养 ， 用 Ｓ Ｆａ
４ ８ ｈ记录卵裂数 ，～ ５７ ｄ记录囊胚发育情况 。
面的多余 组织 ， 然后用 生理盐 水洗 净 ， 用灭 菌纱 布擦 再
干。最后置于盛有抽卵液的培养皿 中。在培养皿 中用手 术 刀片切开卵巢表面 ２ ５ ｍ 的卵泡 ，并用镊子将 卵泡 ～ ｍ
ｏ ｃｅ ｖ ｇ ， ｅｅ３ ． ｆ ｌａ ａ ｅ ｗ ｒ ５６％ ａ ｄ５ ． ｎ ８４％ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｈ ｄｓｇ ｉｃ ｎ ｉｅｅ ｃ Ｐ ＯＯ ） ｅｐ ｃｉ ｌ ，ａ ｉｎｆ ａ ｔ ｆ ｒｎ ｅ（ ＜ ．１ ． ｖ ｉ ｄｆ
Ｋ ｙ ｒ ｓ ｇ ａ ； ｏ ｙｅ ｉ ｉ ｏｃ ｌ ｒ ｅ ｗｏ ｄ ： ｏ ｔ ｏ ｃ ｔ ； ｎｖｔ ｕｔ ｅ ｒ ｕ
７２ ７ ， ． ． 用前置于 Ｃ ～４ Ｏ 培养箱 中预先平衡 ２ 。 ｈ
１３ 卵母 细胞 的体外成 熟培养 ．
．
研 究表 明 ， 岛素 、 铁蛋 白、 硒酸钠 的混合 制剂 （ — 胰 转 亚 ｉ ｎ ｓｌ —ｒｎｆ ｒ ｇ ｓｌ ｉ ＩＳ ｕｉ ｔ ｓ ｒ ｎ—ｅ ｎ ｍ， ）具有提高胚胎发育率 的 ｎ ａ ｅｉ ｅｕ Ｔ 作用 ， 且具 有增 强 Ｅ Ｆ Ｈ （ Ｓ Ｌ 和 氨基 酸 的功 Ｇ 、 ＭＧ Ｆ Ｈ＋ Ｈ）
表 １ ＩＳ Ｔ 对山羊 卵母细胞成熟的影响
熟及胚胎发育 的效率和质量。
由于哺乳动物胚胎工程的快速发展 ，在大 量的研 究
中需要卵母细胞 ， Ｇ 而 Ｖ期卵母细胞来 源较 广 ， 可随时在
卵裂率， ％
培养液成分
Ｃ Ｃ 数， Ｏ ｓ 枚 成熟率， ％
取卵后进行冷冻 ， 在需要时解 冻体外 培养 。此外 ， 根据相
激 素可提高胚胎发育率 ［ 。近年来 ， 大量 的研究 表 明细
胞 因子在哺乳 动物的早期胚胎发育 中起着重要作 用 ， 如 添加 Ｅ Ｆ等因子可提 高胚胎 的发育率和质量 ［－ Ｇ ｚ 。此外 ，
Ｂ Ａ （ 含脂肪 酸 ） Ｓ 不 ＋１％ ＩＳ＋１ Ｆ Ｓｐ Ｔ ０％ Ｂ ，Ｈ值 控制 在
优化体外培养体 系是提高 山羊卵母细胞成熟 、卵裂
和胚 胎发育效率 的关 键 ， 相关研究 发现在培养液 中添加
胚胎培 养液 （ Ｓ Ｆ ａ为 ：Ｏ ｍ Ｏ ａ ） Ｓ Ｆ＋２％ Ｅ Ａ（／） ％ Ａ ｖｖ＋ｌ
Ｎ Ａ （／） Ｍ 谷 氨 酰胺 ＋１ ｇ Ｇ Ｅ Ａ ｖ ＋１ ｖ ｍ ０ ／ Ｅ Ｆ＋８ｍ ／ Ｌ ｎ ｍＬ ｇ ｍ
１ 材 料 与方法
１１ 卵母 细胞 的 来 源及 回收 ．
本试验 以屠宰场云岭黑 山羊 卵巢卵母细胞为实验材 料 。用 切割 法 采 集 卵丘 一 卵母 细 胞 复合 体 （ｕ ｕｕ — ｃｍ ｌｓ
ｏ ｃｔ ｃｍ ｌ ｅ， Ｏ ｓ ｏ将卵巢用含 有 ５ ｇｍ ｏｙ ｏ ｐｅ ｓ Ｃ Ｃ ｅ ｘ ０ ／ Ｌ硫酸
的卵裂和早期胚胎 的发育 。但诸 多的研究却表 明 ， 成熟
２２ Ｇ ． Ｖ期和 ＭＩ 期解 冻后发 育情 况 Ｉ
用优 化 的卵母 细胞 成熟 体 系培养 解 冻后 的 Ｇ Ｖ期 Ｃ Ｃ， Ｏ ｓ其成熟 率为 ３ ．％； １ ５ 用添加有 ＩＳ Ｅ Ｆ的胚 胎 Ｔ和 Ｇ 培 养液培养解 冻后 Ｇ Ｖ和 ＭＩ期孤 雌激活 的卵母 细胞 ， Ｉ 其 卵裂率分别为 ３ ． ５ ．％，差 异极显著 （ ０ １ ５６％、８ ４ ．） ０
ｒｔｓ ｆｈ ｎ ｏ （ Ｍ ＋１ Ｆ Ｓ ａ ｄｈ ｒｕ ｗｔ ％ ＩＳ （ Ｍ ＋１ ａ ｔｅ ｏｔ ｌ Ｏ ｅｏ ｃ ｒ ０％ Ｂ ） ｎ ｅ ｏ ｐ ｉ １ Ｔ ｔ ｇ １ ｈ Ｏ ０％ Ｆ Ｓ＋ ％ ＩＳ ｈ ｄ ｏ ｉ ｉｃｎ ｄ ｆ ｅ ｃ Ｂ １ Ｔ ） ａ ｇ ｆ ａ ｔ ｉｅ ｎｅ ｎ ｓ ｎｉ ｆｒ
散 的卵丘细胞 ， 吹打干净后 ， Ｐ Ｓ中洗 ３ ， 到的裸 在 Ｂ 次 得
卵在 体视显微镜下 ，以异 物针拨动卵母 细胞进行观察 ，
统计第 １ 极体排出的卵母细胞 数。
１ 成熟 卵母 细胞孤雌 激活及培 养 ． ４
对体外 成熟 的卵母 细胞 ， 离子霉素 （ ｎ ｍ ｃ ） 用 ｉ ｏ ｙｉ 联 ｏ ｎ
合 ６Ｄ Ａ － Ｍ Ｐ激活 。具体操作 为 ： 择成熟 的卵母细胞 在 选 含有 ５ ｍ ｌ 离子霉 素的 ｍ Ｏ ａ 液 中处理 ５ｍ ｎ 然后 ￣ ｏＬ ／ Ｓ Ｆａ ｉ， 在含有 ２ ｍ ｌ － Ｍ Ｐ的 ｍ Ｏ ａ ｏ Ｌ６ Ｄ Ａ ｍ ／ Ｓ Ｆ ａ中培养 ４ ， 用培 再 ｈ
ｔ ｅ Ｇ ｎ Ｉ ｏ ｙｅ ａ ｗｅｅ ｔａ ｅ ｎ ａ ｔ ｅ ｏ ｅ ｅｉ ｃｉａｅ ｍｂ ｙ ｕ ｔｒ ｄｕ ｗ ｔ Ｔ ｎ ＧＦ， ｅｒ ｔｓ ｈ Ｖ ａ ｄ ＭＩ ｏ ｃ ｔｓｔ ｔ ｒ ｗ ｄ ａ ｄｐ ｒ ｎ ｇ ｎ ｔ ａ ｔ ｔｄ ｉ ｅ ｒ ｏｃ ｌ ｅｍｅ ｉｍ ｉ Ｉ Ｓ ａ ｄ Ｅ ｈ ｈ ｈ ｃ ｖ ｎ ｕ ｈ ｔ ａｅ ｈ
繁 殖 与 生 理
Ｉ ｈ ｓｓｕ ｙ，ｈ ｏ ｙ ｅ ｒ ｍ ｎｉ ｇｇ ａ ｒ ｓ ｄｔ ｔ ｄ ｔ ｎｖｔｏｃ ｌｕ ｅｓ ｓｅ ．ｈ ｅ ｕｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔｅｍａ ｔ ｒ ｔ ｎ ｎｔ ｉ ｔ ｄ ｔ ｅ ｏ ｃ ｔｓｆｏ Ｙｕ ｌｎ ｏ ｔ ｗｅ ｅｕ ｅ ｓｕ ｙｉｓｉ ｉ ｕｔ ｒ ｙ ｔｍ Ｔ ｅｒ ｓ ｌ ｓ ｏ ｄｔ ａ ｕｕ ａｉ ｏ ｒ ｓ ｈ ｏ
中添加 了 １ ＩＳ 将 Ｏ ％ Ｔ， Ｍ＋１ ０％Ｆ Ｓ设 为对 照组 ， 山 Ｂ 对 高 了胚胎 的发育力。 此外 ， Ｓ Ｉ 还能够协 同并增强 Ｅ Ｆ对 Ｔ Ｇ
胚胎发 育 的作用 以及能 与 Ｆ Ｈ协 同促进 颗粒 细胞 的分 Ｓ
化 ［］ ７ ０本研究 中 ， 卵母细胞成熟培 养及胚胎培养 的基 在 础液 中均加有 Ｅ Ｆ Ｈ Ｇ 、 ＭＧ，且在胚胎 培养液 中还 添加有 Ｂ Ａ及氨基酸 ，所 以本研究 中的 ＩＳ Ｓ Ｔ 发挥 了协 同并增 强 Ｅ ＦＨ Ｇ 、 ＭＧ、 氨基酸 的功 能 ， 从而提 高 了山羊 卵母 细胞 成
养 的基础液 中加入 Ｅ Ｆ和 Ｈ Ｇ，在胚胎培 养液 中添加 Ｇ Ｍ Ｂ Ａ及氨基 酸 ， Ｓ 以优化冷冻后 的山羊卵母细胞体外 培养 体 系 ，提 高 山羊 卵母 细胞成 熟及胚 胎发 育 的效率 和质 量 ， 山羊种 质资源保存 和体外胚 胎生产体 系的建 立奠 为
定基 础。
Ｐ Ｓ中消化 ２ ｉ， Ｂ ｎ并用 细管反 复吹打除去卵母 细胞 外扩 ｍ
１ ． 冷冻保存 卵母 细胞 的解 冻 ５
将装有卵母细胞的冷冻环倒人预先热平衡好 的 ０ ５ ． ２Ｍ 的蔗糖溶液 中， 并在 ３ ． ８ ５℃、 ５％Ｃ 饱 和湿度条件 下孵 Ｏ、
液挤压 出来 。 切剖完成后 ， 在体视显微镜下捡 卵。 根据试
验需 要吸取形态完 整 ， 细胞质致密 ， 色泽均一 ， 卵丘 细胞 在 ３ 层或 ３ 层以上 ， 且包裹致密 的 Ｃ Ｃ 用 于体外培养 。 Ｏｓ
育 ２ ５ ｉ， ～ ｎ 然后将 卵母 细胞移入 ０１５Ｍ的蔗糖溶液 中 ａ ｒ ． ２
并在 ３ ．℃、 ％ Ｃ ： ８ ５ ５ Ｏ 、饱 和湿度条件下再孵育 ５ｍ ｎ 然 ｉ， 后用于成熟培养或孤雌激活。
１ 卵母 细胞成 熟培养液及胚胎 培养液 配制 ． ２
抽卵液 为 ：Ｂ Ｐ Ｓ＋３ ｇ ６ｍ ／ Ｌ丙酮酸 钠 ＋１ ０ ｇ ０ｍ ／ ０ Ｌ葡 萄糖 ＋９ ０ ／ ６ Ｌ青霉素＋５ ｇ ｍｇ ０ｍ ／ Ｌ链霉素 ，用 前在 ３ ７℃ 水浴锅预热 。 成熟液 （ Ｍ） ： ９ （ ｉｉ ） ｍ ｌ Ｏ 为 Ｍ１９ Ｇｂ ｏ ＋１ ｏ Ｌ丙酮 酸钠 ｃ ｍ ／ ＋２ ｍ ｌ ５ｍ ｏ Ｌ谷 氨 酰 胺 ＋０ ７ ／ Ｌ尿 促 性 腺 激 素 ／ ． ５ｕｍ ０ （ ＭＧ）Ｓｒｎ ） ｇ １雌二醇（７ 一 ２ ０ ｇ Ｌ Ｈ （ｅ ｏ＋１ｘ／ １ ３ ｅ Ｉ ｍＬ ７ １１Ｅ） ／ ３ ＋１ ｎ ｍ
（ 见表 ２ ）
表 ２ 解冻后卵母细胞发育情况
卵母细胞 比其他各阶段 的卵母 细胞抗冻能力都强 ］在 。
本研究 中也得到和上 述研究一致的结论 ，将冷冻 Ｇ Ｖ和 ＭＩ Ｉ 期的卵母 细胞解冻处理后 ， Ｖ期 卵母 细胞卵丘细 胞 Ｇ
脱落 ， 成熟率显著低 于新鲜 Ｇ Ｖ期卵母细胞 ， 孤雌激 活后 Ｇ Ｖ和 ＭＩ期 卵裂率分别为 ３ ． ５ ． Ｉ ５ ６％、８ ４％，差异极显 著 （＜ ．１ｏ本研究 虽对冷冻后的卵母细胞体外培养体 系 Ｐ０ ０ 进行 了优化 ， 但胚 胎 的后期 发育效 果不 是太 好 ， 这还 有
７． １５％ ） ｉ ｐｉ ｌ ｏ ｙｅｍａｕａｉｎｓ ｓ ｍ ｕｔ ａｅｔａ ｎ ＯＣ ｔｇ ， ｅｍａｕｅｒｔ ａ １５％ ．ｕｔ ａｅ ． ｔ ｏ ｔ ｃ ｔ ｔｒｔ ｙｔ ｔ ｃ ｌｖ ｔ ｗｉｇＣ ｓ ｎＧＶ ｓ ｅ ｔ ｔｒ ａｅｗ ｓ３ ． Ｗ ｈ ｍａ ｏ ｏ ｅ Ｏ ｉ ｈ ｉ ａ ｈ Ｃ ｌ ｖ ｔｄ ｉ
羊 卵母 细胞进行体外成熟 培养 。结果表 明 ： 两组 间的成 熟率无 显著差异 ， 但对照组 的卵裂率显 著低于添加 １ ％
ＩＳ （ ＜ ． ）见表 １ ｏ由此说明在卵母 细胞 的成熟培 Ｔ 组 尸０ ５（ ０
养液中添加 １ Ｔ 能够显著提高其激 活后孤雌胚胎 的 ％ＩＳ
发育 力 。
能 ］ 。因此 ， 本研究 通过在卵母细胞成熟 培养及胚胎培
将收集 的 Ｃ Ｃ 在 Ｄ Ｐ Ｓ中洗 ３ ， Ｏｓ —Ｂ 次 分别放人 盛有
５ ＬＯ ０ｐ Ｍ液 的 ３ ｔ ０ ｍｍ培养 皿 中，在 ３ ． ５％ Ｃ 饱 ８ ℃、 ５ Ｏ、 和湿度条件下培养 ２ 。将 培养成熟 的卵母细胞用 Ｐ Ｓ ７ｈ Ｂ 液清洗 ３ ，放人含 ０１ 次 ．％透明质酸酶的无 Ｃ Ｍｇ 的 ａ、 ２ ￣
关 理论 处于 Ｇ Ｖ期 的卵母 细胞 因其染 色体被 核膜包 裹 ， 可降低冷冻损伤 ；而 ＭＩ期卵母 细胞纺锤体对温度敏感 Ｉ
４ ８ ｈ记录卵裂数 ，～ ５７ ｄ记录囊胚发育情况 。
面的多余 组织 ， 然后用 生理盐 水洗 净 ， 用灭 菌纱 布擦 再
干。最后置于盛有抽卵液的培养皿 中。在培养皿 中用手 术 刀片切开卵巢表面 ２ ５ ｍ 的卵泡 ，并用镊子将 卵泡 ～ ｍ
ｏ ｃｅ ｖ ｇ ， ｅｅ３ ． ｆ ｌａ ａ ｅ ｗ ｒ ５６％ ａ ｄ５ ． ｎ ８４％ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｈ ｄｓｇ ｉｃ ｎ ｉｅｅ ｃ Ｐ ＯＯ ） ｅｐ ｃｉ ｌ ，ａ ｉｎｆ ａ ｔ ｆ ｒｎ ｅ（ ＜ ．１ ． ｖ ｉ ｄｆ
Ｋ ｙ ｒ ｓ ｇ ａ ； ｏ ｙｅ ｉ ｉ ｏｃ ｌ ｒ ｅ ｗｏ ｄ ： ｏ ｔ ｏ ｃ ｔ ； ｎｖｔ ｕｔ ｅ ｒ ｕ
７２ ７ ， ． ． 用前置于 Ｃ ～４ Ｏ 培养箱 中预先平衡 ２ 。 ｈ
１３ 卵母 细胞 的体外成 熟培养 ．
．
研 究表 明 ， 岛素 、 铁蛋 白、 硒酸钠 的混合 制剂 （ — 胰 转 亚 ｉ ｎ ｓｌ —ｒｎｆ ｒ ｇ ｓｌ ｉ ＩＳ ｕｉ ｔ ｓ ｒ ｎ—ｅ ｎ ｍ， ）具有提高胚胎发育率 的 ｎ ａ ｅｉ ｅｕ Ｔ 作用 ， 且具 有增 强 Ｅ Ｆ Ｈ （ Ｓ Ｌ 和 氨基 酸 的功 Ｇ 、 ＭＧ Ｆ Ｈ＋ Ｈ）
表 １ ＩＳ Ｔ 对山羊 卵母细胞成熟的影响
熟及胚胎发育 的效率和质量。
由于哺乳动物胚胎工程的快速发展 ，在大 量的研 究
中需要卵母细胞 ， Ｇ 而 Ｖ期卵母细胞来 源较 广 ， 可随时在
卵裂率， ％
培养液成分
Ｃ Ｃ 数， Ｏ ｓ 枚 成熟率， ％
取卵后进行冷冻 ， 在需要时解 冻体外 培养 。此外 ， 根据相
激 素可提高胚胎发育率 ［ 。近年来 ， 大量 的研究 表 明细
胞 因子在哺乳 动物的早期胚胎发育 中起着重要作 用 ， 如 添加 Ｅ Ｆ等因子可提 高胚胎 的发育率和质量 ［－ Ｇ ｚ 。此外 ，
Ｂ Ａ （ 含脂肪 酸 ） Ｓ 不 ＋１％ ＩＳ＋１ Ｆ Ｓｐ Ｔ ０％ Ｂ ，Ｈ值 控制 在
优化体外培养体 系是提高 山羊卵母细胞成熟 、卵裂
和胚 胎发育效率 的关 键 ， 相关研究 发现在培养液 中添加
胚胎培 养液 （ Ｓ Ｆ ａ为 ：Ｏ ｍ Ｏ ａ ） Ｓ Ｆ＋２％ Ｅ Ａ（／） ％ Ａ ｖｖ＋ｌ
Ｎ Ａ （／） Ｍ 谷 氨 酰胺 ＋１ ｇ Ｇ Ｅ Ａ ｖ ＋１ ｖ ｍ ０ ／ Ｅ Ｆ＋８ｍ ／ Ｌ ｎ ｍＬ ｇ ｍ
１ 材 料 与方法
１１ 卵母 细胞 的 来 源及 回收 ．
本试验 以屠宰场云岭黑 山羊 卵巢卵母细胞为实验材 料 。用 切割 法 采 集 卵丘 一 卵母 细 胞 复合 体 （ｕ ｕｕ — ｃｍ ｌｓ
ｏ ｃｔ ｃｍ ｌ ｅ， Ｏ ｓ ｏ将卵巢用含 有 ５ ｇｍ ｏｙ ｏ ｐｅ ｓ Ｃ Ｃ ｅ ｘ ０ ／ Ｌ硫酸
的卵裂和早期胚胎 的发育 。但诸 多的研究却表 明 ， 成熟
２２ Ｇ ． Ｖ期和 ＭＩ 期解 冻后发 育情 况 Ｉ
用优 化 的卵母 细胞 成熟 体 系培养 解 冻后 的 Ｇ Ｖ期 Ｃ Ｃ， Ｏ ｓ其成熟 率为 ３ ．％； １ ５ 用添加有 ＩＳ Ｅ Ｆ的胚 胎 Ｔ和 Ｇ 培 养液培养解 冻后 Ｇ Ｖ和 ＭＩ期孤 雌激活 的卵母 细胞 ， Ｉ 其 卵裂率分别为 ３ ． ５ ．％，差 异极显著 （ ０ １ ５６％、８ ４ ．） ０
ｒｔｓ ｆｈ ｎ ｏ （ Ｍ ＋１ Ｆ Ｓ ａ ｄｈ ｒｕ ｗｔ ％ ＩＳ （ Ｍ ＋１ ａ ｔｅ ｏｔ ｌ Ｏ ｅｏ ｃ ｒ ０％ Ｂ ） ｎ ｅ ｏ ｐ ｉ １ Ｔ ｔ ｇ １ ｈ Ｏ ０％ Ｆ Ｓ＋ ％ ＩＳ ｈ ｄ ｏ ｉ ｉｃｎ ｄ ｆ ｅ ｃ Ｂ １ Ｔ ） ａ ｇ ｆ ａ ｔ ｉｅ ｎｅ ｎ ｓ ｎｉ ｆｒ
散 的卵丘细胞 ， 吹打干净后 ， Ｐ Ｓ中洗 ３ ， 到的裸 在 Ｂ 次 得
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统计第 １ 极体排出的卵母细胞 数。
１ 成熟 卵母 细胞孤雌 激活及培 养 ． ４
对体外 成熟 的卵母 细胞 ， 离子霉素 （ ｎ ｍ ｃ ） 用 ｉ ｏ ｙｉ 联 ｏ ｎ
合 ６Ｄ Ａ － Ｍ Ｐ激活 。具体操作 为 ： 择成熟 的卵母细胞 在 选 含有 ５ ｍ ｌ 离子霉 素的 ｍ Ｏ ａ 液 中处理 ５ｍ ｎ 然后 ￣ ｏＬ ／ Ｓ Ｆａ ｉ， 在含有 ２ ｍ ｌ － Ｍ Ｐ的 ｍ Ｏ ａ ｏ Ｌ６ Ｄ Ａ ｍ ／ Ｓ Ｆ ａ中培养 ４ ， 用培 再 ｈ
ｔ ｅ Ｇ ｎ Ｉ ｏ ｙｅ ａ ｗｅｅ ｔａ ｅ ｎ ａ ｔ ｅ ｏ ｅ ｅｉ ｃｉａｅ ｍｂ ｙ ｕ ｔｒ ｄｕ ｗ ｔ Ｔ ｎ ＧＦ， ｅｒ ｔｓ ｈ Ｖ ａ ｄ ＭＩ ｏ ｃ ｔｓｔ ｔ ｒ ｗ ｄ ａ ｄｐ ｒ ｎ ｇ ｎ ｔ ａ ｔ ｔｄ ｉ ｅ ｒ ｏｃ ｌ ｅｍｅ ｉｍ ｉ Ｉ Ｓ ａ ｄ Ｅ ｈ ｈ ｈ ｃ ｖ ｎ ｕ ｈ ｔ ａｅ ｈ
繁 殖 与 生 理
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中添加 了 １ ＩＳ 将 Ｏ ％ Ｔ， Ｍ＋１ ０％Ｆ Ｓ设 为对 照组 ， 山 Ｂ 对 高 了胚胎 的发育力。 此外 ， Ｓ Ｉ 还能够协 同并增强 Ｅ Ｆ对 Ｔ Ｇ
胚胎发 育 的作用 以及能 与 Ｆ Ｈ协 同促进 颗粒 细胞 的分 Ｓ
化 ［］ ７ ０本研究 中 ， 卵母细胞成熟培 养及胚胎培养 的基 在 础液 中均加有 Ｅ Ｆ Ｈ Ｇ 、 ＭＧ，且在胚胎 培养液 中还 添加有 Ｂ Ａ及氨基酸 ，所 以本研究 中的 ＩＳ Ｓ Ｔ 发挥 了协 同并增 强 Ｅ ＦＨ Ｇ 、 ＭＧ、 氨基酸 的功 能 ， 从而提 高 了山羊 卵母 细胞 成
养 的基础液 中加入 Ｅ Ｆ和 Ｈ Ｇ，在胚胎培 养液 中添加 Ｇ Ｍ Ｂ Ａ及氨基 酸 ， Ｓ 以优化冷冻后 的山羊卵母细胞体外 培养 体 系 ，提 高 山羊 卵母 细胞成 熟及胚 胎发 育 的效率 和质 量 ， 山羊种 质资源保存 和体外胚 胎生产体 系的建 立奠 为
定基 础。
Ｐ Ｓ中消化 ２ ｉ， Ｂ ｎ并用 细管反 复吹打除去卵母 细胞 外扩 ｍ
１ ． 冷冻保存 卵母 细胞 的解 冻 ５
将装有卵母细胞的冷冻环倒人预先热平衡好 的 ０ ５ ． ２Ｍ 的蔗糖溶液 中， 并在 ３ ． ８ ５℃、 ５％Ｃ 饱 和湿度条件 下孵 Ｏ、
液挤压 出来 。 切剖完成后 ， 在体视显微镜下捡 卵。 根据试
验需 要吸取形态完 整 ， 细胞质致密 ， 色泽均一 ， 卵丘 细胞 在 ３ 层或 ３ 层以上 ， 且包裹致密 的 Ｃ Ｃ 用 于体外培养 。 Ｏｓ
育 ２ ５ ｉ， ～ ｎ 然后将 卵母 细胞移入 ０１５Ｍ的蔗糖溶液 中 ａ ｒ ． ２
并在 ３ ．℃、 ％ Ｃ ： ８ ５ ５ Ｏ 、饱 和湿度条件下再孵育 ５ｍ ｎ 然 ｉ， 后用于成熟培养或孤雌激活。
１ 卵母 细胞成 熟培养液及胚胎 培养液 配制 ． ２
抽卵液 为 ：Ｂ Ｐ Ｓ＋３ ｇ ６ｍ ／ Ｌ丙酮酸 钠 ＋１ ０ ｇ ０ｍ ／ ０ Ｌ葡 萄糖 ＋９ ０ ／ ６ Ｌ青霉素＋５ ｇ ｍｇ ０ｍ ／ Ｌ链霉素 ，用 前在 ３ ７℃ 水浴锅预热 。 成熟液 （ Ｍ） ： ９ （ ｉｉ ） ｍ ｌ Ｏ 为 Ｍ１９ Ｇｂ ｏ ＋１ ｏ Ｌ丙酮 酸钠 ｃ ｍ ／ ＋２ ｍ ｌ ５ｍ ｏ Ｌ谷 氨 酰 胺 ＋０ ７ ／ Ｌ尿 促 性 腺 激 素 ／ ． ５ｕｍ ０ （ ＭＧ）Ｓｒｎ ） ｇ １雌二醇（７ 一 ２ ０ ｇ Ｌ Ｈ （ｅ ｏ＋１ｘ／ １ ３ ｅ Ｉ ｍＬ ７ １１Ｅ） ／ ３ ＋１ ｎ ｍ
（ 见表 ２ ）
表 ２ 解冻后卵母细胞发育情况
卵母细胞 比其他各阶段 的卵母 细胞抗冻能力都强 ］在 。
本研究 中也得到和上 述研究一致的结论 ，将冷冻 Ｇ Ｖ和 ＭＩ Ｉ 期的卵母 细胞解冻处理后 ， Ｖ期 卵母 细胞卵丘细 胞 Ｇ
脱落 ， 成熟率显著低 于新鲜 Ｇ Ｖ期卵母细胞 ， 孤雌激 活后 Ｇ Ｖ和 ＭＩ期 卵裂率分别为 ３ ． ５ ． Ｉ ５ ６％、８ ４％，差异极显 著 （＜ ．１ｏ本研究 虽对冷冻后的卵母细胞体外培养体 系 Ｐ０ ０ 进行 了优化 ， 但胚 胎 的后期 发育效 果不 是太 好 ， 这还 有
７． １５％ ） ｉ ｐｉ ｌ ｏ ｙｅｍａｕａｉｎｓ ｓ ｍ ｕｔ ａｅｔａ ｎ ＯＣ ｔｇ ， ｅｍａｕｅｒｔ ａ １５％ ．ｕｔ ａｅ ． ｔ ｏ ｔ ｃ ｔ ｔｒｔ ｙｔ ｔ ｃ ｌｖ ｔ ｗｉｇＣ ｓ ｎＧＶ ｓ ｅ ｔ ｔｒ ａｅｗ ｓ３ ． Ｗ ｈ ｍａ ｏ ｏ ｅ Ｏ ｉ ｈ ｉ ａ ｈ Ｃ ｌ ｖ ｔｄ ｉ
羊 卵母 细胞进行体外成熟 培养 。结果表 明 ： 两组 间的成 熟率无 显著差异 ， 但对照组 的卵裂率显 著低于添加 １ ％
ＩＳ （ ＜ ． ）见表 １ ｏ由此说明在卵母 细胞 的成熟培 Ｔ 组 尸０ ５（ ０
养液中添加 １ Ｔ 能够显著提高其激 活后孤雌胚胎 的 ％ＩＳ
发育 力 。
能 ］ 。因此 ， 本研究 通过在卵母细胞成熟 培养及胚胎培
将收集 的 Ｃ Ｃ 在 Ｄ Ｐ Ｓ中洗 ３ ， Ｏｓ —Ｂ 次 分别放人 盛有
５ ＬＯ ０ｐ Ｍ液 的 ３ ｔ ０ ｍｍ培养 皿 中，在 ３ ． ５％ Ｃ 饱 ８ ℃、 ５ Ｏ、 和湿度条件下培养 ２ 。将 培养成熟 的卵母细胞用 Ｐ Ｓ ７ｈ Ｂ 液清洗 ３ ，放人含 ０１ 次 ．％透明质酸酶的无 Ｃ Ｍｇ 的 ａ、 ２ ￣
关 理论 处于 Ｇ Ｖ期 的卵母 细胞 因其染 色体被 核膜包 裹 ， 可降低冷冻损伤 ；而 ＭＩ期卵母 细胞纺锤体对温度敏感 Ｉ
