食品中大肠菌群的检测及分离纯化
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实验8: 食品（饮用水）中大肠菌群的检测（滤膜法） 及分离纯化（6学时）
一、目的要求
1.利用滤膜法测定食品中大肠菌群。
2.掌握分离微生物的基本操作。
二、基本原理
1.滤膜法是采用过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，用水系过滤膜即可，其孔径约0.45μm。
2.在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。
三、试验原料及器材
实验原料：伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋，蛋白胨，灭菌水，饮用水等；
器材：镊子；夹钳；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等。
四、操作步骤
1.大肠菌群的检测
（1）滤膜灭菌
将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
（2）过滤器装置
用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶安装好，其中滤膜用灭菌镊子(浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌)移至过滤器的基座上。其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
（3）将抽滤瓶接上真空泵。
（4）加水样过滤
直径50mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数一般需要较多过滤器装置，多于50个为适宜，所以采用多联过滤器最好，可以减少误差。一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。本次实验于过滤器漏斗内加入比较河水或湖水100ml，加盖。
（5）开动真空泵进行油滤。
（6）抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
（7）滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊
红美蓝琼脂平板上。滤膜与培养基之间不得有气泡。
（8）将平板倒置于37℃下培养22—24小时。
（9）挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落，进行革兰氏染色、镜检。
滤膜装置及培养示意图
2.大肠菌群的分离纯化
（1）制备平板
熔化EMB培养基 冷至60℃左右倒平板三分之一高度 冷凝 平板。
(2)划线纯化
用接种环蘸取典型菌落 在平板上划平行线三条 灼烧接种环,冷却 旋转75度,过第一次划线处作第二次划线与此类推,见实验书P32图15。
培养。
五、结果：
第1部分结果：
1L水样总大肠杆菌=滤膜上大肠杆菌群菌落数×10
第2部分结果：
绘生长特征图
划线图 生长图
