第五章蛋白质合成

实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等 及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合 成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作 模板，任意排列时可出现8种三联子，即 CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、 AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、 Thr、Ly. 基因与基因表达的一般概念 遗传密码——三联子 二. 遗传密码 三联子 三．密码子和反密码子的相互作用 四．tRNA 五．AA- tRNA合成酶 合成酶 六. 核糖体 七. 信使核糖核酸 八、蛋白质的生物合成 氨基酸及功能蛋白质 蛋白质合成后的修饰 九、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰 十、蛋白质的运输和降解
四．tRNA
tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二 遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基 酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运 送到核糖体上提供了载体。所有的tRNA都能够与核 糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶 草型顶端突起部位通过密码子：反密码子的配对与 mRNA相结合，而其3’末端恰好将所转运的氨基酸 送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA称 为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均 专一于相同的氨基酰- tRNA合成酶。
1、tRNA的三叶草型二级结构 、 的三叶草型二级结构
受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对 形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’ 端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或 2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根据3个核 苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有 的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于套索中央的三 联反密码子命名的。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶 （dihydrouracil）命名的。 最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为 2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95个核苷酸不等， tRNA分子长度的不同主要是由其中的两条手臂引起的。 tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个 tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分 布在非配对区，特别是在反密码子3'端邻近部位出现的频 率最高，且大多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环 的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。
4．tRNA的种类 ． 的种类 和延伸tRNA （1）起始 ）起始tRNA和延伸 和延伸 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA 叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生 物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物 起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。 （2）同工 ）同工tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工 tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种 同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AAtRNA合成酶识别。
2．tRNA的L形三级结构 ． 的 形三级结构 酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。 这种结构是靠氢键来维持的，tRNA的三级结构与 AA- tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TφC臂的杆 状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的 杆状区域形成了第二个双螺旋。 tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能，因为 它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上 的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上 的mRNA相配对，所以两个不同的功能基团最大限 度分离。
（3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。 如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨 基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子 （transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把 催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyltRNA Synthetase）。 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU 等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温 AA-tRNA 后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相 对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结 合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未 结合的AA-tRNA分开。
实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。 在含有tRNA、核糖体、 AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入 mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基 酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外 加的模板来决定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多 聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly （C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。 实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核 苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽， 5'…UGU GUG UGU GUG UGU GUG…3',不管读码从U开 始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两 种密码子。
（3）校正 ）校正tRNA 校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。 在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可 能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子 （UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止， 合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为 无义突变。
五．AA- tRNA合成酶 合成酶
AA- tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合 的特异性酶，其反应式如下：
三．密码子和反密码子的相互作用 蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通 过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作 用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆 动假说（wobble hypothesis），解释了反密 码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上 同源密码子的配对问题。
Wobble hypothesis ① 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。 ② 反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。 当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。 当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个 密码子。 ③ 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、 二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。 ④ 根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻 译61个密码子。
一.基因与基因表达的一般概念 基因与基因表达的一般概念
基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其 生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗 传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通 过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所 有生命现象。 编码链（coding strand）又称sense strand，是 指与mRNA序列相同的那条链。非编码链 （anticoding strand），又称antisense strand，是 指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的 DNA链。
遗传密码——三联子 二. 遗传密码 三联子
mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个 氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联 子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿 mRNA5’→3’的方向连续阅读直到终止密码子，生成 一条具有特定序列的多肽链。 mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨 基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表 4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联 子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸 代表一个氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了 编码20种氨基酸的需要。
当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌 中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。 如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育， 核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结 合。
4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子 和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密 码子配对，但能被终止因子或释放因子识别， 终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同 一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy）， 对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子 （synonymous codon）。
3．tRNA的功能 ． 的功能 转录过程是信息从一种核酸分子（DNA） 转移至另一种结构上极为相似的核酸分子 （RNA）的过程，信息转移靠的是碱基配对。 翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构 极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译 成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在 这里起作用的是解码机制。
Genetic information is perpetuated by replication（复 （ 制）in which a double- stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies. 基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation） 两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除 了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。 翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码 翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达 的最终目的。 只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合 成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、 A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将mRNA链上 的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表 一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。
实验5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组 成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种 起读方式： 5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3'分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser） 或CUU（Leu）. 多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽： 5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’由第二种读码 方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨 基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。