质粒提取

1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。

3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。

4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。

5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。

6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。

7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。

8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。

10000rpm离心15min。

9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。

10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。

11.在超速离心管中加样并封口。

60000rpm 10℃离心16h。

12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。

13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一步，直到下层水相中没有桃红色。

转移下层水相到EP管中。

14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。

在-20℃下放置20min。

15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。

16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。

17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。

13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。

18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。

LB培养基配方：试剂1LTryptone(胰蛋白胨) 10gYeast extract（酵母膏；酵母提取物）5gNaCl 5gAgar（琼脂糖）15g碱裂解法原理：本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。

质粒提纯的原理质粒是一种由DNA分子组成的环状双链结构，常见于细菌细胞中。

质粒提纯是指从细菌细胞中分离纯净的质粒DNA，并去除其他细菌细胞成分和杂质的过程。

质粒提纯的原理主要包括质粒提取、细胞裂解、DNA溶解、去除杂质、DNA沉淀、洗涤和干燥等步骤。

1. 质粒提取：质粒提取是通过裂解细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。

常见的方法有碱裂解法、酶裂解法和热裂解法。

其中，碱裂解法是最常用的一种方法。

在碱裂解法中，首先将含有质粒的细菌培养物经离心分离得到菌体沉淀，然后用碱溶解菌体，使细胞壁和细胞膜破裂，释放质粒DNA。

2. 细胞裂解：细胞裂解是指将细菌细胞壁和细胞膜破裂，释放细胞内的质粒DNA。

细胞裂解的方法包括机械破碎、超声波裂解和酶裂解等。

机械破碎法是将经离心得到的菌体沉淀在低温下用椎管等器械进行破碎，使菌体破裂，释放DNA。

超声波裂解法则是利用超声波的高频振动实现细胞破碎，释放DNA。

酶裂解法则通过添加蛋白酶、脱氧核酸酶等酶，使细胞壁和细胞膜被酶降解，释放DNA。

3. DNA溶解：DNA溶解是指将裂解的细胞中的DNA从其他细胞成分中分离出来。

一般来说，DNA可以通过溶于乙醇或异丙醇的方式沉淀下来，然后经过离心分离得到。

此步骤的目的是将DNA和其他细菌细胞成分如蛋白质、RNA等分离。

4. 去除杂质：在DNA溶解的过程中会有一些杂质如蛋白质、RNA等混入溶液中。

为了获得纯净的质粒DNA，需要去除这些杂质。

一般可以通过加入酶解剂如RNase A或蛋白酶K进行酶解，使RNA或蛋白质被降解。

然后通过盐酸/乙醚等混合液体沉淀蛋白质，或者通过乙醇沉淀RNA等方式去除杂质。

5. DNA沉淀：通过加入适量的盐和乙醇，使DNA与DNA溶液中碱性pH值条件下的盐结合形成DNA盐沉淀，同时DNA与乙醇结合形成DNA乙醇沉淀。

此过程中DNA成为不溶性盐和DNA乙醇复合物，通过离心分离沉淀下来。

沉淀条件可以根据实验需要进行调整，如调节盐和乙醇的浓度、温度等。

质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。

下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。

一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。

作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。

在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。

二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。

收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。

分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。

这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。

通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。

碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。

这个实验我们没有做过，但QIAGEN抽提大质粒用的就是碱裂解法。

【质粒抽提的8大窍门】1：摇菌时间-过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。

如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。

2：起始菌体量-大家习惯说“从多少ml菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。

3：菌体的彻底悬浮-如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。

这个团块在溶液III加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

4：使用相对过量的试剂-这是适合所有核酸抽提的建议。

试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。

如果认为这样不经济，就少用一点菌体。

5：裂解时间-加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变得清澈。

体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。

如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。

如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。

6：中和的操作-在 1.5ml离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。

效果非常好。

7：中和后的离心去蛋白-一定要将蛋白质彻底离心下去。

如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。

【降低RNA残留的方法】RNA的去除，首先是使用RNase消化。

在溶液I中加入高浓度的RNase A(100ug/ml)，或者用含25ug RNase A/ml TE溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。