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厌氧芽胞梭菌检验-2
——鉴定
一．复习有关理论知识
1．厌氧芽胞梭菌的微生物学检查程序2．破伤风梭菌的微生物学检查法3．产气荚膜梭菌微生物学检查法
二．实验内容和要求
菌种：①破伤风梭菌②产气荚膜梭菌1．观察细菌的形态、结构、染色性
2．观察细菌的培养特性
3．观察细菌在疱肉培养基中生长现象4．观察产气荚膜梭菌“汹涌发酵现象”5．观察细菌的致病性
三．实验操作
1．观察形态示教片
①破伤风梭菌 ②产气荚膜梭菌
2．观察示教血平板 ①破伤风梭菌 ②产气荚膜梭菌
3．观察疱肉培养基中生长现象
-破伤风杆菌
-产气荚膜杆菌
①
② ① 3-疱肉培养基 ① ② 2-血琼脂平板 ② 1-细菌形态
4．观察产气荚膜梭菌在紫牛乳“汹涌发酵现象”5．观察动物实验结果
①产气荚膜杆菌：小白鼠腹腔解剖
腹腔液涂片、染色、镜检
②破伤风杆菌：小白鼠肌肉病变情况
•厌氧培养方法
四．小结
•评价厌氧菌接种、分离培养结果•小结本次实验情况
•撰写厌氧菌鉴定报告。
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
厌氧菌的分离、培养及鉴定1.1实验内容:厌氧菌的分离、培养及鉴定;1.2目的:1掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
了解厌氧菌菌鉴定的一般方法。
2复习并巩固平时所学的微生物知识与技能。
3培养独立思考、设计和动手实验的能力。
二介绍:厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
厌氧菌的培养:在培养厌氧菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm 的氧平衡时，O2--O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。
每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。
所以说，要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。
厌氧菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法--亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术因此他是世界上第一个分离纯化厌氧菌的人。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
该技术的优点是:预还原培养基制好后，可随时取用进行试验;任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。
三实验材料与设备:3.1分离与培养:3.1.1菌种:待测样品;3.1.2培养基:改良的PRAS培养基(氮素自加)[配方组成--NH4CL1g,MgCl20.1g,K2HPO40.4g,KH2PO40.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青(还原指示剂)1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S(还原剂)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制剂)各0.1ml]3.1.3试剂:冰块Na2SNaHCO33.1.4器材:高纯氮气厌氧管厌氧手套箱注射器恒温培养箱铜柱除氧系统定量加样器厌氧罐超声波破碎仪酒精灯冰块水浴锅记号笔振荡器等3.2菌种的鉴定:3.2.1菌种:待测菌3.2.2培养基;糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基(液体);3.2.3试剂;乙醚吲哚试剂卢戈氏碘液;3.2.4器材:超净工作台恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅接种环移液管载玻片显微镜等四、实验方法与步骤:4.1分离与培养4.1.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
医学微生物学――第十一章厌氧性细菌1．厌氧芽胞梭菌与无芽胞厌氧菌具有的共性是____________。
a．形态染色性b．专性厌氧c．在人体的分布d．致病性e．对人体的危害2．厌氧芽胞梭菌能耐受恶劣环境条件是因为有____________。
a．菌毛b．鞭毛c．荚膜d．芽胞e．内毒素3．破伤风梭菌除致破伤风外还能引起____________。
a．菌血症b．食物中毒c．组织坏死d．坏死性肠炎e．以上都不是4．关于破伤风梭菌的致病性，叙述正确的是____________。
a．该菌污染意外创伤部位或手术伤口而感染b．该菌及其产生的毒素入血引起脓毒血症c．毒素入血产生全身中毒症状d．毒素通过神经、淋巴液、血液到达中枢与周围神经系统e．毒素通过重链与脊髓及脑干组织细胞表面受体结合，通过轻链毒性作用而使肌肉痉挛5．破伤风痉挛毒素作用于____________。
a．神经细胞b．红细胞c．粒细胞d．巨噬细胞e．成纤维细胞6．破伤风梭菌感染的重要条件是____________。
a．该菌芽胞污染伤口b．菌群失调c．伤口厌氧微环境d．该菌的繁殖体污染伤口e．机体无免疫力7．关于破伤风痉挛毒素的特性，叙述正确的是____________。
a．属神经毒素b．属肠毒素c．属细胞毒素d．仅作用于外周神经e．毒性不强8．当一民工因铁钉深刺足底送医院急诊时，医生应首先考虑注射____ ________。
a．破伤风类毒素b．破伤风抗毒素c．白百破三联疫苗d．丙种球蛋白e．破伤风菌苗9．用破伤风抗毒素治疗破伤风，其目的是____________。
a．抑制破伤风梭菌的生长b．阻止细菌产生毒素c．中和结合神经细胞上的外毒素d．中和游离在神经细胞外的外毒素e．中和进入血液中的外毒素10．产气荚膜梭菌可分为多个血清型，对人致病的主要为___________ _。
a．E型b．D型c．C型d．B型e．A型11．产气荚膜梭菌除可引起气性坏疽外，还可引起____________。
厌氧菌的鉴定程序1 概述厌氧菌是一大群专性厌氧菌群，必须严格无菌环境才能生长。
主要分为两类：一类是革兰阳性有芽胞的厌氧梭菌，另一类是无芽胞的革兰阳性和阴性的球菌和杆菌。
大部分无芽胞厌氧菌为条件致病菌，所引起的感染可遍及临床各科和人体各部位，在人体寄居的厌氧菌比需氧菌在数量上占有明显的优势。
2 分类包括革兰阴性球菌和杆菌及革兰阳性球菌和杆菌。
分类主要依据形态、革兰染色、鞭毛、芽胞、荚膜及终末代谢产物来判断。
2.1 革兰阳性厌氧球菌主要包括消化球菌属和消化链球菌属；其镜下形态分别为圆形或卵圆形，排列成双，成链状，黑色消化链球菌排列常呈不规则。
在厌氧血琼脂平板上形成细小不溶血菌落。
生长温度范围25～38℃，最适生长温度为 35～37℃.生长缓慢，一般需要培养 48h 才能形成肉眼可见的小菌落。
在硫乙醇酸盐肉汤中呈现沉淀或絮状，但不浑浊。
2.2 革兰阴性厌氧球菌主要包括韦荣球菌属、氨基酸球菌属、巨球菌属等。
其中韦荣球菌属最为常见，与人体有关的有小韦荣球菌、齿蚀韦荣菌、不典型韦荣球菌和殊异韦荣球菌。
此处仅介绍韦荣球菌属。
韦荣球菌属镜下呈成双、聚集不规则及短链状排列，无动力，厌氧生长，最适温度 30～37℃。
该菌属氧化酶试验阴性，触酶试验不定，不分解碳水化合物，分解乳酸盐产生乙酸盐、丙酸盐、CO2 和 H2，培养时需 CO2才能生长。
初步鉴定根据菌落和镜下形态、革兰染色、对特定抗生素的敏感性和某些快速生化试验；确切鉴定包括糖类发酵试验和气相色谱技术。
该菌属特点为革兰阴性球菌，对多粘菌素和卡那霉素敏感，对万古霉素耐药，还原硝酸盐为亚硝酸盐；在厌氧血琼脂平板上菌落形态为细小、圆形、凸起、灰白色，可初步推断为韦荣球菌属。
2.3 厌氧革兰阴性无芽胞杆菌与人类致病性相关的只要包括拟杆菌属和梭杆菌属，拟杆菌属和梭杆菌属均为革兰阴性杆菌，拟杆菌为短小的规则杆菌，而梭杆菌为细长的梭形杆菌，均不产生芽胞，不能进行有氧代谢，严格无氧环境生长。
