兽残分析中样品的采集、保存、制备与前处理技术及方法建立步骤共80页文档

水产品兽药残留检测样品前处理技术 2、提取方法
l 超临界流体密度与液体相似，但是溶质在其中的扩 散系数比液体中大得多。
l 极性低的碳氢化合物，醚，酯，环氧化合物，可以 在低压力下提取（7-10MPa）进行萃取，羟基，羧 基难萃取，一个羧基和两个羟基的化合物和三个酚 羟基的苯环衍生物可以被萃取；40 MPa以下，糖和 氨基酸都不能被萃取；分级极性差异和挥发性差异。
2.建立测定方法 建立测定方法和线性范围，为后续的各种工作提供分析手段，最 后根据干扰和使用情况逐步确立测定条件和建立标准曲线。如兽 残及代谢物属中等极性或较高极性化合物，不能直接进行GC分析， HPLC常用的检测器有紫外（UVD），荧光（FLD，共轭双烯）,电 化学（EehlD）。MS为非常规检测器。
8. MRM优化模式优化Tube Lens Offset和Collision Pressure
9.记录并保存子离子全扫描质谱图。保存Tune Method文 件。
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合确立LC条件
5. 选择MS Only优化模式和Syringe Pump Infusion入口类 型选项
6.优化Tube Lens Offset、Spray Voltage、Sheath Gas Pressure、Aux Gas Pressure获得待测化合物稳定的准 分子离子峰。
7.选择MS+MS/MS优化模式设置Parent Mass、Charge State和Num Product对子离子进行优化。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
3、净化方法
固相萃取（SPE）
水产品兽药残留检测样品前处理技术

关于动物检疫样品的采集和检疫方法动物检疫是保护国家农业和畜牧业健康的重要措施。

而动物检疫样品的采集和检疫方法对保障动物健康和农业生产至关重要。

本文将介绍关于动物检疫样品的采集和检疫方法，希望能够对动物检疫工作有所帮助。

一、动物检疫样品的采集1. 选择样品采集地点在动物检疫样品采集之前，首先需要选择样品采集的地点。

一般来说，选择具有代表性的地点采集样品，确保样品的准确性和可靠性。

要注意在采集样品的过程中避免受到外界环境的污染。

2. 样品采集工具在采集动物检疫样品的过程中，需要使用专门的工具进行采集，例如采集棒、无菌容器、无菌手套等，确保采集过程不受到外界环境的干扰和污染。

不同种类的动物检疫样品，采集方法也会有所不同。

一般来说，对于血液样品，可以采用采血管进行采集；对于粪便、尿液等样品，可以使用无菌容器进行采集。

对于组织样品，需要进行手术采集，并确保采集过程的无菌。

1. 样品标本的保存在采集样品之后，需要将样品标本妥善保存，确保样品的完整性和新鲜度。

一般来说，常用的保存方法有冷藏和冷冻，根据不同的样品特点进行选择合适的保存方法。

对于动物检疫样品的检测，可以根据不同的疫情和检测目的，选择合适的检测方法。

常用的检测方法有PCR检测、ELISA检测等，这些检测方法可以对不同的病原体进行准确的检测和诊断。

3. 样品处理在进行样品检测之前，需要对样品进行处理，去除杂质和干扰物质，确保检测结果的准确性和可靠性。

还需要进行标本的配制和稀释，以便于后续的检测操作。

4. 结果分析在样品检测完成之后，需要对检测结果进行分析和解读。

通过对检测结果的分析，可以做出相应的防控措施，保障动物健康和农业生产的安全。

畜禽血液样品的采集、制备与保存方法预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制畜禽血液样品的采集、制备与保存方法血液不断地在全身流动，参与机体的各种功能活动，对动物的新陈代谢以及维持内环境和保持与外界环境间的平衡起着重要的作用。

当血液发生病理变化时，常常会影响全身的组织和器官，而组织和器官的病变又可以引起血液成分的变化，因此，血液的检验在疾病的诊断中起到十分重要的作用；临床检验采用的血液样品分为全血、血清和血浆。

全血主要用于血细胞成分的检验，血清和血浆主要用于大部分临床化学检查和免疫学检验。

血液样品的采集、制备与保存是重要的前期工作，是保证正确诊断的基本条件。

1.采集部位与方法畜禽血液样品的采集部位和方法，与种类、检测项目、试验方法及用血量有关，视实际情况而定。

1.1鸡的采血技术1.1.1翅静脉采血：是常用的采血部位，翅静脉在肘关节腹侧的表面，清晰地暴露于皮肤之下，肉眼可见。

采血时先拔去该部位的羽毛，抽血时，动作轻柔缓慢，防止血管塌陷不回流，采血后略移动皮肤轻压即可止血；由于鸡的皮肤游离性大，采血后容易形成血肿。

1.1.2心脏采血：此方法多用于进行尸体剖检前的血液采集检验。

将鸡仰卧保定，针头从V型锁骨前端刺入，或者在靠近心脏的胸侧壁刺入；心脏采血过程中，如果操作不慎，易损伤肺脏，更有慎者，引起大出血死亡。

1.1.3颈静脉采血：鸡的左侧颈静脉很细，通常右侧颈静脉采血。

在皮肤上的一个无毛的沟正好是右侧颈静脉所处的位置。

颈静脉游离性大，皮肤松弛，采血后易于形成血肿。

1.2猪采血技术1.2.1前腔静脉采血：猪前腔静脉是由左右两侧的颈静脉与腋静脉至第一对肋骨间的胸骨柄汇合形成。

采血时，针头刺入部位在与耳根和对侧肩胛骨上缘连线垂直线的胸骨端处，大猪采用站立保定，小猪可以采用仰卧保定法。

左侧靠近膈神经，故以右侧采血为宜。

1.2.2耳静脉采血：一般用于体格较大的猪。

保定后，耳部消毒灭菌，以手指压迫近心端耳部静脉，使血管努张，针头刺入血管后，动作要轻柔，采血要缓慢，否则血液不回流使静脉瘪陷。

兽药残留检测概述
3.建立样品处理方法 提取，净化，衍生 4.标准曲线 LC-MS/MS要求设4个点，相关系数大于0.995，有外标 （基质匹配法）和内标，标准加入法，基质匹配法。 5.稳定性试验 一般包括标准溶液（溶剂）和样品中贮存条件下的稳 定性试验，如室温，冷冻，反复冷冻-解冻条件下的稳 定性。 6.方法评价 准确度，精密度，灵敏度等。
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
建立液质定量分析方法
1、确立质谱条件（化合物优化）
建立液质定量分析方法
2、确立LC条件


在液相-紫外检测中，使用的添加剂的种类繁多，可以是挥 发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不 易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理， 我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到 极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、 乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。三乙 胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测中是绝 对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除，残留及其严 重，能够抑制离子的响应。 在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间R≥1.5，进行定量 ，那R最好≥2.0，要求准确的配制流动相，精确的调好流动 相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常使用 多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，由于MRM 要求选择两次离子，因此它具有很高的专属性，基于这点 我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达到完 全分离就可以对他们进行定量分析。
水产品兽药残留检测样品前处理技术
4、浓缩富集及再溶解
旋转蒸发：溶剂可回收 气流吹蒸：少量溶剂 K-D浓缩器：浓缩，回流，洗涤，定容 真空离心：热敏性组分，粘稠液体 再溶解使用流动相的初始比例作溶剂

前处理方法的建立

4、净化方法 1）液液萃取LLE 2）固相萃取SPE 3）固相微萃取（SPME） 4）制备色谱法（HPLC、TLC） 5）凝胶渗透色谱法（GPC） 6）吹扫-捕集（P&T） 7）膜分离技术 8）浸透限制固定相（RAS） 9）基质固相分散技术（MSPD） 10）免疫亲和柱（IAC） 11）分子印迹技术（MIPs) 12)其他技术
前处理方法的建立
5、浓缩与富集
-旋转蒸发浓缩 -气流吹蒸法
-浓缩器浓缩
-真空离心浓缩 浓缩过程组分最容易损失
前处理方法的建立

6、衍生化 -反应速度快 -容易重复 -定量完全、转化率稳定 -产物易纯化 -产物易于分离和检测 -GC衍生化方法 -HPLC衍生化方法 -衍生化方式： 柱前、柱后、固相衍生化、光化学衍生化

定量限：LOQ（limit of quantitation) 一般LOD≤0.2MRL LOD=B+10SD 一般CV ≤20%，回收率≥70%方法建立步骤 ຫໍສະໝຸດ
6、分析方法的评价 （4）线性范围 R≥0.9900，R2 （5）选择性 内源性物质的干扰 代谢物的干扰 其他药物的干扰 （6）与参比方法的分析结果比较 （7）实验室协同研究（collaborative study) -实际样品、添加样品 -一般3个实验室，影响方法至少8个 -考虑地域、气候、部门、行业等 7、分析方法报告 8、分析质量监控
浓度（ug/kg) 小于1 1-10 10-100 大于100
允许范围（%） 50-120 60-120 70-110 80-110
方法建立步骤
6、分析方法的评价 （3）检测限与定量限 检测限:LOD（limit of detection) 一般LOD≤0.1MRL LOD=B+3SD 不作定量可靠性要求（精密度、回收率等）

➢ 对内分泌功能的影响 ➢ 对生育能力的影响 ➢ 儿童性早熟
过敏反应
➢ 青霉素类、四环素类、磺胺类等
对人类肠道微生物的影响
破坏或抑制人体胃肠菌群中敏感菌的生长。 ➢ 0 g 匀浆样品和10 g 经煅烧的无水硫酸钠，于50 mL 二氯甲烷，均质提取1min， 3000r/min 离心2 min, 上清液经快速滤纸过滤到200
➢环境污染物
兽药残留产生的主要原因
➢ 不遵守休药期的规定 ➢ 标签外用药:
❖剂量、剂型、给药途径、疗程、适应症、动物
➢ 非法使用违禁药物
❖克伦特罗、己烯雌酚等
➢ 污染
❖饲料加工、贮藏、运输
兽药残留毒性
➢急性毒性作用 ➢慢性毒性作用 ➢特殊毒性作用 ➢病原菌的耐药性 ➢对胃肠道菌丛的影响
急性毒性
OCH3 N
N
OCH3
sulfadim ethoxine (SD M X )
OCH3
OCH3
N N
OCH3 N
N
NN
OCH3
sulfamethoxypyridazine (SPMX) s u lfa d im e th o x in e ( S D M X ) sulfamonomethoxine (SMMX)
2．磺胺类药物
主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺 二甲嘧啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近 年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超 标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期 摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后，药 物可不断在体内蓄积。
磺胺类药物的毒性作用
❖ 损害泌尿系统
氯霉素、氨基糖苷类、灰黄霉素等 正常情况下，动物性食品中天然存在的性激素含量是很低的，因而不会干扰消费者的激素代谢和生理机能。

前处理方法的建立

1、概述 目的：分离-检测 基本内容： 提取、净化、浓缩、衍生化
2、样品预处理 采集 制备 贮存
前处理方法的建立
3、提取方法 1） 样品种类 尿液、血浆、胆汁、奶、蛋、动物组织（肉、肝、
肾等）

2）提取溶剂 -相似相溶原则 -一般采用乙腈、甲醇和丙酮等水溶性溶剂 -混合溶剂，增加选择性
方法建立步骤
2、建立测定方法 紫外可见（UV/Vis)、红外（IR）、荧光（Fluor）、核磁共 振（NMR）、质谱（MS）等 3、建立样品处理方法 ——最为重要的步骤 提取、净化、浓缩、衍生化 4、标准曲线（定量手段） 外标法 内标法（质谱一般用待测物的稳定同位素标记物）
方法建立步骤
前处理方法的建立

3）提取方法 -组织捣碎法（homogenization) -振荡法(shaking) -索氏提取法(Soxhlet extraction) -超声波辅助提取（SAE） -超临界流体萃取（SFE） -强化溶剂萃取（ASE） -微波辅助萃取（MAE） -消解法：酸消解、碱消解、酶消解 -其他技术：冷冻干燥、制备干混物、起泡分离
浓度（ug/kg) 小于1 1-10 10-100 大于100
允许范围（%） 50-120 60-120 70-110 80-110
方法建立步骤
6、分析方法的评价 （3）检测限与定量限 检测限:LOD（limit of detection) 一般LOD≤0.1MRL LOD=B+3SD 不作定量可靠性要求（精密度、回收率等）
精密度的要求： 待测物浓度(mg/kg) 100 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001

2.2.3 提取方法



超临界流体萃取：使用超临界流体萃取 仪 原理：超临界流体为兼具气态和液态性 质的特殊状态，萃取的速度快。 特点：速度快，选择性强，易于净化。 获得的样品可以直接进行分析，如进行 GC或HPLC测定等。
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2.2.3 提取方法

强化溶剂萃取：是由超临界流体萃取衍 生出来的一种提取方法。采用溶剂作流 体，在高温、高压下提取样品。其操作 温度比索氏提取发高，从而使溶剂具有 更强的溶解能力。与索氏提取相比，速 度快（10-20分钟），溶剂用量小（15 毫升）。设备价格昂贵。
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2.2.3 提取方法



如何提高提取速度？ 提高样品的破碎程度，以增加扩散面积， 减少扩散距离 搅拌和重复提取 延长提取时间 使用黏度小的溶剂，适当提高温度
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2.2.3 提取方法

组织捣碎法:又称匀浆提取法,一般将样 品和3-5倍样品体积的溶剂加入捣碎杯, 高速搅拌或匀浆。将样品过滤或离心后 移取提取液，残渣重复提取1-2次，合并 提取液进行净化。不需要加热，速度快， 提取效果好。
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2.2.2 提取溶剂的选择



遵循相似相溶的原则 对待测组分溶解度大，对于干扰杂质溶 解度小 与样本基质有较好的相容性，能有效释 放药物 具有脱蛋白和/或脱脂肪能力 毒性低、易纯化、价格低廉、易于进一 步净化。
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常用提取溶剂
农业部畜禽产品质检中心广州提高样品的破碎程度以增加扩散面积减少扩散距离使用黏度小的溶剂适当提高温度农业部畜禽产品质检中心广州组织捣碎法

兽医研究中的样品采集及保存方法介绍金光耀，杨　阳，任梦非（黑龙江省野生动物研究所，哈尔滨　１５００８１）摘要：样品采集法被广泛应用于动物检疫及科研教学中，发挥着重要的作用。

就兽医科学研究中的样品采集及保存法进行了介绍。

关键词：兽医科学；研究；样品采集；进展中图分类号：Ｓ８５１．３４ 文献标识码：Ｂ　文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０１４）０５－００５９－０１ 随着科学技术的发展，兽医科学的研究也不断加深，对免疫学和病原学都展开了研究。

在兽医科学研究中，样品的采集方法是展开免疫学和病原学研究的基础，因此，本文就样品采集及保存方法进行了阐述。

１　样品采集方法样品采集就是样品取样的一种方式，一般包括原始样品、平均样品及检样３种。

随着兽医科学研究的深度不断提升，也使得对样品的选择具有广泛性特点，对样品的数量及种类的提取也逐渐严格起来。

１．１　免疫学１．１．１　血清的采集　免疫学研究主要以血清为研究对象，血清的获取就需要采取动物的血液，并对血液进行处理。

对于不同的动物，其采血位置和血液采集量各不相同。

例如：对于牛、羊而言，一般采用颈静脉采血；禽采用翅静脉采血；猪采用前腔静脉采血；对小鼠采血，少量采血采用断尾法，大量采血采用摘取眼球法、心脏采血法；猫、狗采血，一般在后肢外侧的小隐静脉、颈静脉及股动脉处采血等。

对于静脉采血，一般要反复多次，为了避免栓塞影响整个动脉，就要从远心端开始。

对于血清的分离一般采用离心分离；采血对动物会带来一定的损害，对于生产性能带来不利的影响。

１．１．２　单克隆抗体和分泌液　单克隆抗体对于免疫学的研究具有重要的价值，它主要利用杂交瘤细胞技术等，采集鼠腹水制备而成，是应用在实验室的诊断试剂，具有特异性强、均一性好的特点，因而被广泛应用；在免疫学研究过程中，一些分泌液也作为研究的对象。

采集呼吸道分泌物的方法：采用灭菌的棉拭子蘸取咽喉或鼻腔的分泌物，并及时将棉拭子放入保存液中，进行合理的保存，用于免疫学研究。

1.1.11 抽样单填写


样品编号：格式为[动物品种代码]/[样 品种类代码]/[抽样日期]。 例：2001年7月10日抽取的牛肝样品第一 份，其编号为：B/L/010710-1。
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代码
动物 牛 品种 代码 B 羊 O 猪 P 鸡 C 肾 K 兔 R 鱼 F 蜂蜜 Be
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2 样品前处理
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 概述 提取方法 净化方法 浓缩与富集 化学衍生化技术
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2.1 样品处理-概述




目的:将待测组分从样品基质中分离出来，并 达到仪器能够检测的状态。 主要作用包括:将药物从样品中释放出来、除 去样品中的干扰杂质、将待测组分转换为可检 测的形式、达到可检测的浓度范围和溶于可进 行分析的介质。 主要包括四项基本内容：提取、净化、浓缩、 衍生化。 分离或组分转移是贯穿整个样品处理过程的基 本问题：液-液萃取、固相萃取
200-500克 (取6只鸡全肝) 400-500克 (取5只兔全肝)
双肾各取1/2 （纵切）
6只鸡全肾 5只兔全肾
200克
50-100克 (6只鸡脂肪) 5只兔脂肪
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1.1.6 养殖场抽样数量
猪、羊（尿样、血液） 动物数量（样本数） 50 51100 抽样数（个） 5 8
1.3 样品保存运输



为确保被分析物的稳定性和样品的完整性，采 集的样品应由专人妥善保存，并在规定的时间 内送达检测单位。 取样后冻肉样应在冷冻状态下保存，蜂蜜： 10℃，禽蛋：0～4℃，牛奶：2～6℃条件下储 存。 生鲜样品取样后应在0℃～4℃条件下24小时内 送达检测单位。 运输工具应保持清洁无污染。 防止贮存地点和装卸地点可造成的污染。

尿样：收集清晨饲喂前的尿液100～200 ml。 蛋：从产蛋架上抽取，取样量不少于10枚； 奶：从全场混合奶中取，取样量不少于1000 ml。 蜂蜜：每个样品量为1000克
8
1.1.5 一个组织样品的组成
动物 牛 羊 猪 鸡 兔
肌肉 300-500克 300-500克 300-500克 300-500克 300-500克
3
1.1.1 抽样的基本原则
严格按照规定的程序和方法执行，确保 抽样工作的公正性和样品的代表性、真 实性。
4
1.1.2 人员
抽样人员不少于2人 抽样人员应经过专门的培训，具备相应
资质。 抽样人员应携带身份证、工作证、单位
介绍信、抽样单等文件。
5
1.1.3 工具
肉类：不锈钢刀具、自带封口的食品卫生塑料 包装袋、低温样品保存箱（盒）、一次性手套、 标签、盛放微生物检验用样品的灭菌容器等。
17
鸡蛋
按批次分别在货件不同部位随机抽样 在50件以内者，抽检2件； 50至100件者，抽检4件； 101至500件者，每增加50件增抽1件（所
增不足50件者，按50件计）； 500件以上者，每增加100件增抽1件（所
增不足100件者，按100件计算）。
18
1.1.9 市场样品采集
液体乳品 一般可采用虹吸法，或者用简 单的玻璃管按不同深度分层取样。对于 黏稠或含有固体悬浮或非均匀乳品应充 分搅匀，然后再进行取样。总量应不少 于500克。
蜂蜜 心 Hb H
鸡 兔 鱼 蜂蜜
C R F Be 肾 血液 尿液 蛋
KB 肺脑
UE 皮肤 毛发
Lu C S Ha
采样单填写
样品名称：所取样品的种类及部位。例：血样，全肝，背脊肉等。 动物品种：所取样品动物的名称。 年 龄：牛、羊按年计，猪按月计，兔、鸡按日计。 抽样基数：抽样当天的出栏率（养殖场）、屠宰量（屠宰厂）、

兽药残留分析中样品前处理技术作者：孙正阳张甜甜来源：《中国科技博览》2017年第20期[摘要]兽药残留分析中样品前处理技术对检测结果具有直接影响，是残留分析工作的关键步骤。

科学技术的发展让样品前处理技术不断进步，近年来更是出现了许多能有效减少样品前处理过程误差的新技术。

本文介绍了一些样品前处理新技术的基本原理及特点，并阐述了其在兽药残留分析中的应用。

[关键词]兽药残留；样品前处理技术；基本原理；应用中图分类号：S859.84 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）20-0385-01兽药残留监控是兽药研究、开发、使用及管理工作的重要内容。

兽药残留物的分离纯化由于残留物水平较低等原因难度较大，而样品前处理技术作为兽药残留分析的重要环节对检测结果具有关键性的影响。

一些新型的样品前处理技术具有样品量少、选择性优、自动化处理等优于传统技术的特点。

1 固相萃取（SPE）1.1 固相微萃取（SPME）固相萃取能通过固体吸附剂分离液体样品目标化合物与样品基质和干扰物，尔后利用洗脱液的洗脱作用分离和富集目标物。

固相萃取是兽药残留分析样品前处理的主要技术，其应用日益广泛，并随着科学技术的发展分化出了特殊固相萃取前处理技术。

固相微萃取作为特殊的固相萃取技术之一，具有样品、溶剂用量小，操作简便的优点，并同时具有萃取、浓缩、解吸、进样的功能。

固相微萃取的精密性、重现性、回收率均具有很好的水平，一些技术人员将固相微萃取技术和其他技术相结合检测水样中的农药、牛奶中药物残留，均获得了满意的结果。

1.2 基质固相分散萃取（MSPD）基质固相分散萃取也是固相萃取的一种，具有灵敏度高、准确度好、精密度高、操作步骤较少的优点，省略了组织匀浆、沉淀、离心、调节酸碱度、转移样品等操作。

基质固相分散萃取的基本原理是将吸附填料、样品混合后进行研磨，并在研磨物处于半干状态时进行装柱操作，然后进行洗脱，并对待测物进行收集、浓缩净化操作，最后进行仪器分析。

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在进行动物造模后样本采集之前，需要进行充分的准备工作。