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一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法王大威;张健;姜伟;张凤久【摘要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】5页(P142-146)【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳【作者】王大威;张健;姜伟;张凤久【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027【正文语种】中文脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广泛的应用[1] 。
大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居多。
目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。
实验2 产表面活性剂菌株的筛选1.实验原理：菌种筛选包括富集、分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。
一般情况下，产表面活性剂的铜绿假单胞菌由于其土壤中广泛存在，生长迅速，糖脂产量高，非常容易筛选出来。
但由于铜绿假单胞菌是条件致病菌，芽孢杆菌具有很多优良特性，因此有意识地筛选芽孢杆菌显得更有意义。
芽孢耐热性较好，在沸水中水浴10min仍然能够存活，因此可以利用这一特性对芽孢杆菌进行初筛。
表面活性剂可以使红细胞破裂。
产表面活性剂的菌株在血琼脂平板上培养时，会形成溶血圈，溶血圈的大小与表面活性剂的产量往往成正比。
因此，可以利用血琼脂平板对产表面活性剂菌株进行初筛。
摇瓶发酵的微生物生物表面活性剂产量评价方法一般有排油圈法、表面张力法、比色法、液滴崩塌法等。
排油圈法比较简便，但不准确，可以进行初步评价筛选，然后再用表面张力法重新评价、确认。
在对培养基成份进行鉴定后，可用比色法进行精确的测定。
本次实验需6-9个课时。
2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、表面张力仪、培养箱、显微镜、冰箱、纯水机、移液枪等。
2.2试剂革兰色染色液、三氯甲烷、0.5M H2SO4等。
培养皿(洗净烘干)，150 mL三角瓶，250mL三角瓶，配套封口膜(配棉绳或橡皮筋)或硅胶塞若干，报纸一叠，15mL试管及配套硅胶塞(或试管帽、棉塞等)，玻棒，标签纸，记号笔(蓝、黑)，500mL、100mL、50mL烧杯，药匙，卫生纸，称量纸，pH试纸(5.8-9.0)，滴瓶(加1M NaOH溶液)，5mL刻度吸管等。
2.3培养基芽孢富集培养基（g/L）：可溶性淀粉3，蛋白胨10，酵母膏3，KH2PO4 1.5，K2HPO4 2，MgSO4 0.1，pH 7.4。
营养肉汤培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 5 ，PH7.4。
肉胨培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 5，pH 7.4。
脂肽类生物表面活性剂研究进展沈玉江（大庆华理能源生物技术有限公司，大庆163000）摘要：脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂，在医药、食品、化妆品和微生物采油等方面有良好的应用潜力。
本文对脂肽的筛选、评价、提取、应用及展望等方面进行了综述。
关键词：微生物代谢产物脂肽生物表面活性剂中图分类号：TQ016 文献标识码：A 文章编号：Progress of Lipopeptide BiosurfactantsAbstract: The lipopeptide typically synthesized by microorganisms which is an important kind of biosurfactants,and it has a great potential in pharmaceutics,foods,cosmetic,oil recovery and many other fields.This paper reviews lipopeptide-producing,isolation and identification of the lipopeptide and its applications.Key words:Miroorganism Metabolite Lipopeptde Biosurfactant生物表面活性剂可分为6大类：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂。
脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，具有化学合成品很难具有的独特的两亲性分子结构，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成。
脂肽类生物表面活性剂不仅具有高效、低毒、无污染等优点，而且可以生物降解为无害产物，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景，已成为研究开发的热点。
生物表面活性剂产生菌的筛选及表面活性剂稳定性研究*牛明芬1,2李凤梅2韩晓日1郭书海2**牛之欣2 冷延慧2 张春桂2(1沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161;2中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016)摘 要 大庆油田油泥样品经富集培养,平板分离,获得52株菌。
排油性实验和表面张力测定表明,菌株B 22、B 24、B 25产生的表面活性剂表面活性稳定,表面张力较低。
温度、pH 和N aCl 浓度实验证实,细菌B 22产生的生物表面活性剂可耐受120 高温,另2种生物表面活性剂可耐受80 ;3种细菌生物表面活性剂对pH 有广泛适应性,B 22pH 适应范围为4 0~13 0,B 24、B 25的pH 适应范围为2 0~13 0;Na Cl 浓度对表面活性剂的生物活性影响不大。
将3株菌的生物表面活性剂用于室内油泥处理实验,72h 石油去除率达70%以上。
关键词 表面张力,生物表面活性剂,油泥处理中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2005)06-0631-04Isolation of biosurfactant producing microorganisms and their stability.N IU M ingfen 1,2,L I Feng mei 2,HAN X iaori 1,G UO Shuhai 2,N IU Zhix in 2,L EN G Yanhui 2,ZHAN G Chungui 2((1College of L and and Env ir on ment,S heny ang A gricultural U niver sity ,Shenyang 110016,China;2I nstitute of A p plied Ecology ,Chinese A cademy of Sciences ,Shenyang 110016,China).Chinese Jour nal of Ecology ,2005,24(6):631~634.52biosurfactant producing microo rganisms were isolated with the methods of enrichment culture and plate cultivation fro m o il sludge of Daqing Oil Field.Experiments of oil displacement activity and surface tension show ed that the three strains (including B 22,B 24and B 25)had high surface activity and lo w surface tension.T he analysis of physico chemical properties indicated that the biosurfactant produced by B 22could bear high temperatur e up to 120 ,while the ot her two could bear 80 .T he three biosur factants had a wide adapt ability to pH.B 22had a w ide adaptable pH rang e of 4.0~13.0,while that o f B 24and B 25was 2.0~13.0.Na Cl co ncentration had no obv ious effect on the biological activ ity of the biosurfactants.Employing the 3strains biosurfactants to treat oil sludge,more than 70%of the oil was removed after 72h.Key words sur face tension,biosur factants,oil sludg e.*国家重点基础研究发展规划项目(2004CB418500)、国家高技术研究发展计划前沿探索课题(2004AA649060)和中国科学院沈阳应用生态研究所知识创新工程资助项目(SLYQY0401)。
丁立孝：男，1965年生，博士，副教授。
E-mail:<lixiaoding65@>.收稿日期：2003-05-19接受日期：2003-10-15农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):330~333·研究论文·脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选丁立孝1何国庆1刘晔2李海军2林建强2（1.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029；2.山东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100）摘要:从220个采自大庆油田和胜利油田的油土样和油水样中，经富集培养，血平板和油平板分离，液滴坍塌法、排油法和表面张力法进一步复筛，筛选出了8株产生物表面活性剂的优良菌株。
经过薄层层析(TLC)和红外光谱分析(FT-IR)鉴定，有4株菌产脂肽表面活性剂，其中59号菌株最好，其表面活性剂可以把表面张力降到31mN/m 而且具有良好的乳化活性。
关键词:生物表面活性剂；微生物；筛选方法；脂肽Isolation and Screening of Microbe Producing Lipopeptide SurfactantDING Li-Xiao 1HE Guo-Qing 1LIU Ye 2LI Hai-Jun 2LIN Jian-Qiang 2（1.Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China;2.State Key Laboratory of Microbial Technology ,Shandong University,Jinan 250100,China）capable of producing biosurfactants could be isolated by a series of step including enrichment culture,hemolytic activity assay on blood agar plates,hydrolyzing oil activity assay on oil agar plates and oil displacement activity etc.Then the fermentation supernatant of first-isolated strains was secondly screened by a drop-collapsing method and surface tension method.Eight strain bacteria were isolated with higher surface activity from 220samples of oil-contaminated soil and water collected from Daqing Oil Field and Shengli Oil Field.The results of TLC and IR analysis showed that biosurfactant of four strain bacteria was lipo-peptide and strain 59was the best one amongthem.biosurfactant;microorganism;screening method ;lipopeptide微生物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌产生的一些具有一定表/界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，称为生物表面活性剂（biosurfactants ）[1]。
生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似，具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能，但相比之下，还有许多有利之处[2]：①可生物降解，不会造成再污染；②无毒或低毒；③一般不致敏和可消化，因此可用于化妆品、食品的添加剂；④可以从工业废物中生产，用于生物环境治理；⑤具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、pH 和盐浓度下的更好选择性和专一性；⑥结构多样，有可能适用于特殊领域。
随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、医药、食品加工等方面的潜在应用价值的研究，已引起人们对在工业规模上用生物技术生产表面活性剂的强烈兴趣[3]。
生物表面活性剂是20世纪70年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。
由于这些特点，生物表面活性剂的研究日益增多，并可能替代化学合成的表面活性剂。
许多种类表面活性剂可由微生物产生，生物表面活性剂可分为6大类[4]：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂等。
本研究主要介绍筛选产生脂肽生物表面活性剂菌株的各种方法，以及生物表面活性剂的测定分析，为生物表面活性剂的研究和生产奠定基础。
1材料和方法1.1筛选材料1.1.1筛选样品取自大庆油田和胜利油田被石油长期污染的油土样和油水样共220个样品。
1.1.2富集培养基（%）葡萄糖2，硫酸铵0.1，硝酸钠0.2，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠第3期丁立孝等:脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选0.4，酵母粉0.05。
1.1.3血平板培养基（%）牛肉膏0.3，蛋白胨1，酵母粉0.01，氯化钠0.5，琼脂粉1.6，羊血8。
1.1.4斜面培养基，LB培养基[5]。
1.1.5摇瓶培养基，同富集培养基。
1.2菌株筛选和培养1.2.1富集培养将油水样和油土样按3%的接种量分别接种到富集培养基中，180r/min，37℃条件下振荡培养3d。
1.2.2血平板筛选利用生物表面活性剂能够溶血的特性[6]，将富集培养液用划线和涂布分离方法接种于血平板上，37℃培养24~48h，挑选溶血好的单菌落接种斜面上，作进一步研究。
1.2.3油平板筛选油平板制作方法是利用去掉碳源后的固体富集培养基倒平板，然后在其上加上一张已灭菌的并均匀浸有原油的粗滤纸，把富集的培养液划线接种于以原油为唯一碳源的油平板上，37℃保温保湿培养5~7d。
只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用石油形成噬油斑。
挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上作进一步研究。
1.2.4摇瓶培养将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中，180r/min，37℃振荡培养3d，发酵液离心后进行复筛和表面活性的测定。
1.3表面活性测定1.3.1生物表面活性剂排油活性测定取一培养皿，加蒸馏水，水面上加上0.1mL正十六烷烃形成油膜。
在油膜中心加摇瓶发酵液，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，圆圈直径与表面活性剂含量成正比。
圆圈直径大于9cm的菌株保留作进一步的研究。
1.3.2液滴坍塌法测定，利用96孔板的盖进行实验(每孔内径8mm，高约0.25mm，Biolog，Hayward，California)，具体操作见文献[7]。
1.3.3表面张力的测定采用环法测定表面张力，仪器为JzhY1-180型界面张力仪（河北省承德实验机厂）。
1.3.4生物表面活性剂乳化性能测定取一试管，加5mL煤油和5mL表面活性剂溶液（浓度与原发酵液相同），用XSC-200-1型超声波发生器（上海东亚仪器厂）于800W处理40s，在不同时间测量乳化液和油相体积。
1.4生物表面活性剂的化学结构分析1.4.1薄层层析（TLC）分析取1mL发酵液离心，上清液用氯仿/甲醇（2/1,V/V）抽提后进行薄层层析，展层剂为氯仿/甲醇/水（65/15/2,V/V/V）。
显色剂为：（1）苯酚-硫酸试剂：3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中，糖脂显棕色斑点。
（2）钼酸铵-高氯酸显色剂：磷脂显色剂，参见文献[8]。
（3）茚三酮显色剂：0.5%无水丙酮溶液。
脂肽显红色。
1.4.2红外光谱（FT-I R）分析把提取的纯品生物表面活性剂用KBr压片法测红外吸收光谱(仪器为NICOLET NEXUS470FT-IR SPECTROMETER)。
2结果和分析2.1菌株筛选结果从220个油水样品和油土样品中，经富集培养，血平板和油平板分离以及斜面培养获得约650株菌株。
通过3次摇瓶培养，对发酵液用液滴坍塌法、排油活性和表面张力测定法进行复筛，得到了表面活性稳定，排油直径大于9cm，表面张力较低菌株8株（表1）。
而且这些菌株都是细菌，经初步鉴定[9]，其中3株是芽孢杆菌属（sp.），4株是假单胞菌属(sp.)，1株是节杆菌属(sp.)。
从表1可以看出，59号菌株可以把培养基的表面张力从56mN/m降低到31mN/m，它在血平板和油平板上形成的溶血斑和噬油斑见图1和图2。
2.2生物表面活性剂TLC分析为了对经过初筛和复筛获得的菌株所产的表面活性剂进行初步鉴别，首先对8株菌的发酵液做TLC分析，结果见表2。
从表2中可以看出，其中3表1生物表面活性剂产生菌的筛选结果Table1The isolation of microorganisms producing biosurfactants株编号种类排油圈直径/cm表面张力/mN·m-1液滴坍塌时间/s Strain No.Type Diameter Surface tension Drop-collapsing time 22110.632.712.559＞1231.09.6 1099.836.615.2 11611.232.213.6 5269.534.214.8 42910.233.512.3 2179.634.816.0789.238.116.2331农业生物技术学报2004年株芽孢杆菌产脂肽表面活性剂，4株假单胞菌产糖脂表面活性剂，1株节杆菌也产糖脂表面活性剂。
图1.59号菌株在血平板上形成的溶血斑Fig.1.Hemolytic zone of biosurfactant from strain59on blood agar plate图2.59号菌株在油平板上形成的噬油斑Fig.2.Hydrolyzing oil spot of biosurfactant from strain 59onoil agar plate表2生物表面活性剂TLC 结果Table 2The TLC results of biosurfactants2.3生物表面活性剂FT -IR 分析从以上实验结果可以看出，59号菌株是一株理想的研究菌株，因此下面以该菌株为例进行了生物表面活性剂的提取纯化，对其发酵液中脂肽表面活性剂的提取和纯化见文献[10]。
用真空干燥的纯品进行FT-IR 分析（图3），在IR 谱图上，3311.00cm -1是由分子链间氢键引起的NH 伸缩振动，3070.83cm -1是NH 基团的分子内氢键引起的NH 伸缩谱带，1652.18cm -1及1538.98cm -1分别为酰胺谱带Ⅰ和Ⅱ。
