最新 人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法-精品

一种新的提取脂肪间充质干细胞的方法及对提取细胞的分离、培养及鉴定张校通;海泉;胡忠国;申重阳;赵令卉;王小燕;陈静娴;郑榆坤【摘要】Purpose： To explore and establish a new method of isolating adipose-derived stem cell （ADSCs） from tumescent liquid. Methods：Human tumescent liquid containing adipose-derived stem cell was collected and adipose-derived stem cells were isolated and expanding cultured in vitro. The growth and proliferation activity of adipose-derived stem cell were systematically analyzed. Moreover, growth curves of cells isolated with different approach were drawn and surface antigens against mesenchymal stem cell markers were detected with flow cytometry. Muhi-direetional differentiation properties including adipocytic trans-differentiation, osteogenic differentiation and chondrogenic differentiation of ADSCs had been verified. Results： The method of isolating adipose-derived stem cell from tumescent liquid was established. The cell number from this method was lower when compared to the old method that directly isolate adipose-derived stem ceils from the same volume of adipose tissue, however, growth curves analysis demonstrated that stem cells isolated from new method increased quickly. Similar to stem cells from adipose tissues, these stem cells could achieve plateau phase at 8 day. Meanwhile, adipose-derived stem cell surface markers, including CD73, CD90, CDI05, CD45, CD34, CD1 lb, CD19, HLA-DR were normally expressed and positive stem cells were identical in two methods which were detectedby flow cytometry. Furthermore, adipose-derived stem cells were identified with multi-directional differentiation properties including adipocytic trans-differentiation, osteogenic differentiation and chondrogenic differentiation. Conclusion： cells isolated with new method had been verified as real adipose-derived stem cells and were in accord with the defination standard of international society for stem cell research.%目的：探讨建立一种新的从膨胀液中提取脂肪间充质干细胞（ADSCs）的分离方法。

脂肪干细胞分离培养
1. 向脂肪组织加入等体积2*P/S的PBS，充分混匀，彻底移除上清，上述步骤重复2次；
2. 用DMEM培养基（不含血清）把胶原酶I(collagenase I)储液稀释至0.01%（工作液浓度），把上述洗涤后的脂肪组织转移至新的50ml 离心管，加入脂肪组织体积5倍的胶原酶I工作液浓度，用小剪刀把脂肪组织剪碎，用封口膜封口后，把置于37℃水浴锅中, 孵育30min，每隔5 min弹匀一次；
3.加入消化液等体积的完全培养基（DMEM, 10%FBS，1*P/S）终止胶原酶消化，离心（1200g, 10min）沉淀细胞；
4. 加入10倍细胞沉淀体积的完全培养基重悬沉淀，用孔径100um的尼龙膜细胞筛滤掉组织块；
5. 把细胞接种于10cm的培养皿中（接种密度为30-50%），加入完全培养基至总体积为10ml；
6. 24h后，进行换液以移除未贴壁的细胞；
7．每隔2-3天进行半量换液，待细胞长满至密度为80-90%时进行传代；
8. 第一次传代后的细胞为P1代细胞，P1代细胞长满至密度为80-90%时进行冻存；
9. 传代，保种，拍照：每代（P0，P1，P2，P3）均需拍照；每代（P0，P1，P2，P3）均需保种，一半保种，一般传代。

脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。

由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。

提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。

本文将对这些方法进行介绍和比较。

1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。

接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。

消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。

接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。

最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。

以上提取方法各有优劣。

机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。

为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。

《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言随着生物医学的快速发展，干细胞的研究已经成为一个重要的研究领域。

人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种多能性干细胞，具有来源广泛、获取简便、免疫原性低等优点，在再生医学、组织工程和药物研发等领域具有广泛的应用前景。

本文旨在研究人脂肪干细胞的分离培养方法以及其多向分化潜能，为进一步的临床应用提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本研究所用的人脂肪组织来源于健康成年志愿者的抽脂手术剩余物。

实验所用试剂及设备均为高品质，满足研究要求。

2. 方法（1）ADSCs的分离培养首先，对脂肪组织进行清洗和酶消化处理，以释放出其中的干细胞。

然后，通过离心、过滤等方法将干细胞从混合细胞中分离出来。

将分离出的干细胞接种于培养皿中，加入适当的培养基进行培养。

（2）多向分化潜能研究在ADSCs的培养过程中，通过调整培养基的成分和条件，诱导ADSCs向成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等方向分化。

通过观察细胞的形态变化、免疫荧光染色等方法，验证ADSCs的多向分化潜能。

三、实验结果1. ADSCs的分离培养通过上述方法，成功地从脂肪组织中分离出ADSCs，并进行了培养。

在显微镜下观察，可见ADSCs呈纺锤形或多角形，具有较高的增殖能力。

2. 多向分化潜能研究（1）成骨细胞分化在特定的成骨诱导条件下，ADSCs可分化为成骨细胞。

通过ALP染色和钙结节染色等方法，验证了ADSCs的成骨分化能力。

（2）成脂肪细胞分化在特定的成脂肪诱导条件下，ADSCs可分化为成脂肪细胞。

通过油红O染色等方法，观察到了ADSCs的成脂肪分化现象。

（3）成软骨细胞分化在特定的成软骨诱导条件下，ADSCs可分化为成软骨细胞。

通过免疫荧光染色等方法，验证了ADSCs的成软骨分化能力。

四、讨论本研究成功地从人脂肪组织中分离出ADSCs，并对其进行了培养。

通过调整培养基的成分和条件，成功诱导了ADSCs向成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等方向分化。

人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。

大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。

近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。

研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。

本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。

1材料与方法1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。

低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司).1.2方法1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。

加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。

《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言随着再生医学和细胞治疗领域的不断发展，干细胞的研究成为了当前医学领域的热点之一。

其中，人脂肪干细胞（ADSCs）因其易于获取、低免疫原性、多向分化潜能等特点，受到了广泛关注。

本文旨在探讨人脂肪干细胞的分离培养方法以及其多向分化潜能的研究。

二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括：人脂肪组织、细胞培养基、胰酶、抗生素等。

2. 方法（1）人脂肪干细胞的分离与培养取健康成年人皮下脂肪组织，采用胶原酶消化法将脂肪组织分散成单个细胞。

通过差速贴壁法，将ADSCs从其他细胞中分离出来。

将分离出的ADSCs接种于培养瓶中，加入适量的培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

（2）多向分化潜能研究对培养的ADSCs进行成骨、成脂、成神经等多向分化诱导，观察其分化情况，并通过相关指标检测其分化效果。

三、实验结果1. 人脂肪干细胞的分离与培养通过差速贴壁法，成功从人脂肪组织中分离出ADSCs。

在培养过程中，ADSCs呈现典型的成纤维细胞形态，生长旺盛，无污染。

2. 多向分化潜能研究（1）成骨分化经过成骨诱导后，ADSCs逐渐形成矿化结节，ALP等成骨相关指标明显升高，表明ADSCs具有成骨分化的能力。

（2）成脂分化成脂诱导后，ADSCs内出现大量脂滴，Oil Red O染色呈红色，表明ADSCs具有成脂分化的能力。

（3）成神经分化成神经诱导后，ADSCs表达神经元特异性标志物，如NeuN、MAP2等，表明ADSCs具有成神经分化的潜能。

四、讨论人脂肪干细胞因其易于获取、低免疫原性、多向分化潜能等特点，在再生医学和细胞治疗领域具有广阔的应用前景。

本实验成功地从人脂肪组织中分离出ADSCs，并对其多向分化潜能进行了研究。

实验结果表明，ADSCs具有成骨、成脂、成神经等多向分化的能力，为其在再生医学和细胞治疗领域的应用提供了理论依据。

然而，ADSCs的分化机制仍需进一步研究。

《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种重要的细胞资源，近年来在医学和生物学领域中引起了广泛关注。

这种细胞类型不仅在临床医学上被广泛应用于治疗各种疾病，同时在科学研究领域，它的多向分化潜能及生物机制也是备受瞩目的研究方向。

本文就人脂肪干细胞的分离培养方法和多向分化潜能的研究进行了系统性的探讨。

二、人脂肪干细胞的分离培养1. 分离方法人脂肪干细胞的分离主要依赖于酶解法。

首先，从供体脂肪组织中获取足够的细胞，通过使用含有特定酶的溶液（如胶原酶）来分解脂肪组织，使ADSCs得以释放。

随后，通过离心和筛选过程，获取纯度较高的ADSCs。

2. 培养方法ADSCs的体外培养通常使用含有生长因子和营养物质的特殊培养基。

这些培养基提供了细胞生长所需的营养和环境条件。

在培养过程中，应定期更换培养基，以确保细胞持续得到所需的营养供给。

同时，也需要关注细胞的生长状况和活力。

三、多向分化潜能研究1. 分化为成骨细胞ADSCs具有分化为成骨细胞的能力，这一过程可以通过添加适当的诱导剂和调节生长因子来实现。

在分化过程中，可以通过观察细胞的形态变化和特定基因的表达情况来评估其分化的程度和效果。

2. 分化为成脂细胞ADSCs还可以分化为成脂细胞，这一过程可以通过调整培养基中的营养成分和生长因子来实现。

成脂细胞的分化可以通过观察细胞的脂滴形成和特定基因的表达情况来评估。

3. 分化为神经细胞除了成骨细胞和成脂细胞外，ADSCs还具有向神经细胞分化的潜能。

这一过程可以通过特定的诱导剂和培养条件来实现。

对分化后的神经细胞进行功能测试和基因表达分析，可以评估其分化的效果和潜能。

四、结论通过对人脂肪干细胞的分离培养和多向分化潜能的研究，我们可以更好地了解这种细胞的特性和功能。

ADSCs的分离培养方法已经相对成熟，使得我们可以获取大量的细胞进行后续研究。

同时，ADSCs的多向分化潜能也为临床治疗提供了新的可能性和思路。

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其鉴定殷莉波;赵文秀;尹震宇;杨中萌;张琼;王效民【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)032【摘要】背景:人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞,同时也可以向其他胚层分化,证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞. 目的:探讨人脂肪间充质干细胞的分离、鉴定方法.方法:整形外科吸脂术获得腹部皮下脂肪,0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获得人脂肪间充质干细胞,绘制细胞增殖曲线,进行流式细胞、细胞周期、免疫荧光等检测,并验证其是否具有多功能分化潜能.结果与结论:获得形态较均一的长梭形的人脂肪间充质干细胞,细胞增殖良好,有明显的指数生长期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式检测细胞高表达CD105、CD90,低表达CD34、CD45;多数细胞周期检测G0/G1期占80%以上.能向成脂、成骨诱导分化.结果表明,实验分离获得的细胞是具有脂肪间充质干细胞特性的细胞,为深入研究人脂肪间充质干细胞打下基础.【总页数】4页(P5997-6000)【作者】殷莉波;赵文秀;尹震宇;杨中萌;张琼;王效民【作者单位】厦门大学医学院临床医学系,福建省厦门市,361005;厦门大学附属中山医院肝胆外科,福建省厦门市,361004;厦门大学附属中山医院肝胆外科,福建省厦门市,361004;厦门大学附属中山医院肝胆外科,福建省厦门市,361004;厦门大学医学院临床医学系,福建省厦门市,361005;厦门大学附属中山医院肝胆外科,福建省厦门市,361004;厦门大学生命科学院,福建省厦门市,361005;厦门大学附属中山医院肝胆外科,福建省厦门市,361004【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.人脂肪间充质干细胞体外分离、培养的方法研究 [J], 张云巍;徐丽娟;王淑芳;喻红彬;阎丽2.人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定 [J], 韩冬;徐煌;张新红;肖燕萍3.体外分离培养人脂肪间充质干细胞及鉴定 [J], 李兴天;黄彬;黄海霞;陈军;李遇梅4.分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体 [J], 王静;蔡霞;王志国;徐全臣;李坤;华骋5.分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体 [J], 王静; 蔡霞; 王志国; 徐全臣; 李坤; 华骋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为近年来备受关注的一种多能干细胞，其来源广泛、易于获取，具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，在再生医学和临床治疗中具有广阔的应用前景。

本文旨在研究人脂肪干细胞的分离培养方法及其多向分化潜能，为ADSCs在医学领域的应用提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括：人脂肪组织、培养基、胰蛋白酶、胎牛血清等。

2. 方法（1）ADSCs的分离与培养从人脂肪组织中获取ADSCs，采用组织消化法进行分离。

将获得的细胞接种于培养皿中，加入适量培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

（2）ADSCs的鉴定通过流式细胞术鉴定ADSCs的表面标志物，如CD34、CD90等。

（3）ADSCs的多向分化潜能研究将ADSCs分别诱导分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞，观察其形态变化及分化相关基因的表达情况。

三、实验结果1. ADSCs的分离与培养通过组织消化法成功从人脂肪组织中分离出ADSCs，并可在体外进行传代培养。

培养的ADSCs呈纺锤形或多角形，具有典型的干细胞形态。

2. ADSCs的鉴定流式细胞术鉴定结果显示，ADSCs表达CD90等干细胞标志物，而不表达造血系标志物如CD45等，表明所获得的细胞为纯度较高的ADSCs。

3. ADSCs的多向分化潜能研究（1）成骨分化：将ADSCs诱导为成骨细胞后，细胞形态发生变化，出现钙结节等特征性表现。

RT-PCR结果显示成骨相关基因如RUNX2、OCN等的表达水平明显提高。

（2）成脂分化：在特定条件下将ADSCs诱导为成脂细胞后，细胞内出现大量脂滴。

RT-PCR结果显示成脂相关基因如PPA Rγ等的表达水平显著升高。

（3）成软骨分化：将ADSCs诱导为成软骨细胞后，细胞形态发生变化，形成软骨样结构。

RT-PCR结果显示软骨相关基因如COL2A等的表达水平提高。