第三章 蛋白质的化学修饰

PEG修饰蛋白及其应用
被修饰蛋白种类 无基质牛血红蛋白
SOD
L-ASNase Bovine IL-2 TNF-a
抗肿瘤抗体 Β-葡糖苷酸酶抗体
修饰目的 延长血浆半衰期,降低肾毒性
延长血浆半衰期 降低免疫原性
降低免疫原性 降低免疫原性
增加水力动力学半径 增加抗肿瘤效能,降低毒副作用
肿瘤定位 增加稳定性,改善药代动力学特性
2 降低抗原性和免疫原性
通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化 为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无免疫原性的PEG分 子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏 障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状 PEG具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有 效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用,PEG修饰正是为 达到这一目的。研究表明,利用mPEG 5000对TNF-a进行化 学修饰,通过对修饰条件的优化处理,不仅能够有效减少毒副 作用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度 分别为29%和56%时,其抗肿瘤活性分别增加了4倍和100倍。 与天然TNF-a相比,修饰产物的分子量明显增大,延长了药物 的有效作用时间,降低了毒副作用,促进了它作为抗肿瘤药物 的应用。
由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性, 使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种 具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有 以下三个方面:(1)增加稳定性,延长血浆半衰期;(2)降低 免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。
1 增加稳定性和延长血浆半衰期
一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的 时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过 PEG修饰,一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率;另 一方面,偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减 弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长 了蛋白在循环系统内的保留时间。

转移
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而

终止修饰反应的方法
加入某种化学试剂(通常为氨基酸 与修饰剂反应 加入某种化学试剂 通常为氨基酸)与修饰剂反应，从而消耗 通常为氨基酸 与修饰剂反应， 掉游离的修饰剂； 掉游离的修饰剂； 通过洗滤、 通过洗滤、超滤或透析将修饰蛋白与未修饰蛋白和游离的修 饰剂分开； 饰剂分开； 改变反应条件，如反应的pH值等 使修饰反应停止。 值等， 改变反应条件，如反应的 值等，使修饰反应停止。
pH：多数情况下，在蛋白质等电点附近的pH范围内，增加 ：多数情况下，在蛋白质等电点附近的 范围内， 范围内 pH可以提高反应速率，降低 可以减小反应速率。 可以提高反应速率， 可以减小反应速率。 可以提高反应速率 降低pH可以减小反应速率 反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的pH下即可以与蛋 反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的 下即可以与蛋 白质迅速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较高的pH。 白质迅速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较高的 。
蛋白质侧链基团的化学修饰(以下简称化学修饰 蛋白质侧链基团的化学修饰 以下简称化学修饰) 以下简称化学修饰
通过选择性试剂(下称修饰剂) 通过选择性试剂(下称修饰剂)或亲和标记试剂与蛋白质分子侧 链上特定的功能基团(下称功能基)发生化学反应而实现的; 链上特定的功能基团(下称功能基)发生化学反应而实现的; 应用： 应用： 酶和蛋白质的各级结构以及作用机理； 酶和蛋白质的各级结构以及作用机理； 蛋白质纯度分析与鉴定； 蛋白质纯度分析与鉴定； 蛋白质和酶分子的固定化； 蛋白质和酶分子的固定化； 蛋白质分子的改性
蛋白质的化学修饰
定义 通过活性基团的引入或除去， 通过活性基团的引入或除去，而使蛋白质一级结构发生改 变的过程，统称为蛋白质的化学修饰。 变的过程，统称为蛋白质的化学修饰。 蛋白质的化学修饰主要包括两个方面： 蛋白质的化学修饰主要包括两个方面：

2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要 用于-S-S-的还原剂。
连四硫酸钠或钾 是一温和的氧化剂， 常用于-SH的可逆 保护剂。
2.1.4 芳香环取代反应
蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲 电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典 型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的 酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特 殊光谱，可用于直接的定量测定。
-H2O
[H]
P-NH2 + RCHO +H2O P-N=CHR
P-NH-CH2R
2.3.2 电荷消失的修饰
这 不带类电试。剂可抑制Lys--NH2的质子化, 使形成的衍生物 1. 乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成 乙酰化衍生物。
2. 芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用, 生成的衍生物 为黄色，可定量测定-NH2。 (其它:DNFB\DNS)
2.1 特定的AA残基侧链 基团的反应试剂（4种）
2.1.1 酰化及其相关反应
这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、 硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温 (20ºC~25ºC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与蛋白质某些 侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化 反应。
2.1.2 烷基化反应
此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯 甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子， 因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋 白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。
2.1.3 氧化和还原反应
H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能 将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧 化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光 敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。