流式细胞功能检测

流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法

基本原理

其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：

1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器

PBS溶液；

PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇

400目筛网

流式细胞仪

实验步骤

1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2. 3ml PBS洗涤1次。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

一、简介

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

TH1与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌）

K：不加菲 A：5000ug/L菲 B: 500ug/L C: 500ug/L

1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600

2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。）

3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。

4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。

7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

流式细胞仪主要技术参数

1.光学系统：

1.1*激光配置:配置488nm、638nm激光器，488nm、638nm激光功率都不低于50mW。可选配405nm激光，405nm激光功率不低于80mW。

1.2检测参数：至少可同时激发和检测4色荧光。

1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。光学滤光片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校。

1.4#采用新型检测器，能够达到5倍于传统高性能PMT的光电转换效率，每个通道配备独立检测器，电压可独立调节。

1.5*光信号收集系统, NA不小于1.3，能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中，最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集。

1.6* 系统具备进一步升级的能力，可升级至3激光13色。

2.分析性能：

2.1颗粒检测能力：可准确区分0.2um和0.3um的细胞或微粒。

2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10 MESF。

2.3荧光分辨率：CV≤3%（G0/G1期最高峰）。

2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准确。

3.电子系统：

3.1信号处理精度：20比特100万道原始信息量（1,048,576 channels）。

3.2高达107的线性动态范围，可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上。

3.3支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒以上。

3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析。 4.液路系统：

4.1自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染。

4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，开关机程序全自动完成，全部由自动软件控制。

4.3#上样速度：除常见低、中、高速外，用户可连续自定义样本进样速度（10-240uL/min）。

5.软件功能：

5.1操作系统：Window 7或以上版本。