实时荧光定量PCR仪技术参数

实时荧光PCR技术的应用

医学检验：

基因诊断: 不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。刘敬忠等报道使用dsDNA结合染料SYBR Green I，结合融解曲线分析对α-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊断[11]。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症(β地贫)患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。

肿瘤的分子诊断: 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病,这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认。癌因的突变和表达增加,在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。

传染病检验：

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物种、品种鉴定 ■■ HLA 配型分析

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实时荧光定量PCR方法简介

一． 实时荧光定量PCR的基本原理

理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的

在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义

Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系

Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势

由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

荧光定量PCR技术服务流程

一. 引物和探针的设计

1. 公司专利的Beacon技术（针对microRNA的检测）。

a. 将mRNA序列转换成DNA序列。取3’末端5～6个碱基的区域，使之退火温度达到16℃（按照A、T=2℃;C、G=4℃的原则计算）。并用oligo 6 写出mRNA的反向互补序列。（方法：将序列粘贴至oligo 6，用“Change”选项中的“Strands”。）

b. 正向引物的设计：

先根据mRNA的部分序列设计正向引物，长度为15个碱基左右序列与mRNA一致，5’端与mRNA的5’端起始碱基一致，使当前引物退火温度达到40～42℃，在引物的5’末端添加碱基，最终使引物退火温度达到56℃左右，计算原则同上。引物总长尽量短。

注意：检查正向引物自身形成的二聚体。3’端互补不超过3个碱基。

c. Beacon探针的设计：

将mRNA反向互补序列的16℃部分连同后面的2～3个碱基（注意：这2～3个碱基与正向引物的重叠不超过三个碱基。）复制下来，然后在此序列前后部分别添加相应的互补序列，作为“茎环结构”中的“茎”部分，此结构必须严格配对，目前通用序列为CGCAGG和CCTGCG，可供参考。在序列和前半部分的茎序列之间应添加若干碱基，使Beacon探针的退火温度达到60℃左右。当然也可在此序列后部和后半半部分的茎序列之间添加，但要注意和正向引物的重叠。

注意：用oligo 6软件不时的检查茎环结构是否存在，以及此探针和已设计完的正向引物之间的二聚体情况。

d. 茎环结构逆转录引物的设计：

用Beacon探针的前部茎环节构序列参与“茎”的部分，即GGCCCTG和GCCAGCG。然后在反向引物和探针序列之间添加2～3个碱基，长度在40个碱基左右。目前通用序列为：

GGCCCTGACATCAGATGTGTTGGCTATACG＋探针除了后半部分“茎”序列的部分，可供参考。

注意：需检查所设计引物的结构情况。