实验一培养基的配制及灭菌
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实验一培养基的配制及灭菌
实验一 培养基的配制及灭菌
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。
一、实验目的
1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。
2．明确培养基的配制原理。
3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。
二、实验原理
灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过 180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的
目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏 I 号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在 高温下熔化成液体，而在 45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满
足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的 pH 偏酸；细菌、放线菌的 pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的 pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：
LB培养基配方（pH 7.0）：
胰蛋白胨（Tryptone）
10.0 g
酵母提取物（Yeast extract）
5.0 g
氯化钠（NaCl）
10.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至 7.0，用去离子水定容至1L，在0.1MPa压力下灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH 7.0）：
牛肉膏 3.0 g
胰蛋白胨（Tryptone）
10.0 g
NaCl
5.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
高氏 I号培养基配方（pH 7.4-7.6）：
可溶性淀粉 20.0 g
NaCl
0.5 g
KNO3
1.0 g
K2HPO4∙3H2O
0.5 g
MgSO4∙7H2O
0.5 g
FeSO4∙7H2O
0.01g
琼脂粉（Agar）
20.0 g
去离子水
1000 mL
马铃薯培养基配方（自然 pH）：
马铃薯（去皮） 200.0 g
葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar）
20.0 g
去离子水
1000 mL
察氏培养基配方（自然 pH）：
蔗糖（glucose） 30.0 g
NaNO3
2.0 g
K2HPO4
1.0 g
KCl
0.5 g
MgSO4∙7H2O
0.5 g
FeSO4∙7H2O
0.01 g
琼脂粉（Agar）
20.0 g
去离子水 1000 mL
YPD培养基配方（pH 7.0）：
酵母提取物（Yeast
extract） 10.0 g
蛋白胨（Peptone）
20.0 g
葡萄糖或蔗糖（Dextrose
or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000mL
在0.1MPa压力下灭菌20min。
三、实验材料
牛肉膏蛋白胨、高氏 I号、LB、PDA、YPD、察氏等各种培养基。
四、仪器设备及用具
1. 90mm培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH 试纸（pH 5.5～9.0）、记号笔、麻绳、纱布等；
2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅。
五、试剂
无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、NaCl、琼脂粉、5mol/L NaOH、1mol/L HCl、KNO3、K2HPO4∙3H2O、MgSO4∙7H2O、FeSO4∙7H2O等。
六、实验步骤
1．洗涤
用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次，控干水分。
注意事项：
①不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻
璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
②用过的器皿应立即洗涤。
③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。
④洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。
2．器皿包扎
（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的不锈钢桶中，然后进行灭菌。
（2）吸管：洗净，烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4～5cm的纸条，以 30～50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌，使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。
（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的
微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎。
3．烘干
洗净的仪器控去水分，放在烘箱内烘干，烘箱温度为 105～110℃烘1小时左右。此法适用于一般仪器。对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电吹风机吹至完全干燥。不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。
4．培养基的配置
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
A、称量
按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑
取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
B、融化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
C、调节 pH
在未调 pH前，先用精密 pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其 pH，直至 pH达 7.6。反之，用 1mol/LHCL 进行调节。对于有些要求 pH较精确的微生物，其 pH的调节可用酸度计进
行。 pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。
D、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。
E、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）。
