实验一培养基的配制及灭菌
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实验一 培养基(de)配制及灭菌
培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物.各类微生物对营养(de)要求不尽相同,因而培养基(de)种类繁多.在这些培养基中,就营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.培养基(de)配制,一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育(de)需要,二是培养基在使用前不带菌,三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化.培养基(de)灭菌通常在培养基配制后进行,其目(de)是杀灭培养基中残存(de)微生物或活(de)生物残体,保证培养基在贮存过程中不变质,也防止其他生物对培养(de)污染.
一、实验目(de)
1．掌握实验室常用玻璃器皿(de)清洗、干燥和包扎方法.
2．明确培养基(de)配制原理.
3．掌握配制培养基(de)一般方法和步骤.
4．了解湿热和干热灭菌(de)原理,并掌握有关(de)操作技术.
二、实验原理
灭菌是指杀灭物体中所有微生物(de)繁殖体和芽孢(de)过程.消毒是指用物理、化学或生物(de)方法杀死病原微生物(de)过程.灭菌(de)原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性,从而达到灭菌(de)作用,实验室中最常用(de)就是干热灭菌和湿热灭菌.
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内(de)蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de).细胞内(de)蛋白质凝固性与其本身(de)含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高（160～170℃）,时间长（1～2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃.否则,包器皿(de)纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧.
高压蒸气灭菌是将待灭菌(de)物品放在一个密闭(de)加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间(de)水沸腾而产生蒸气.待水蒸气急剧地将锅内(de)冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸气不能溢出,而增加了灭菌器内(de)压力,从而使沸点增高,得到高于100℃(de)温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de). 在同一温度下,湿热(de)杀菌效力比干热大.其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热(de)穿透力比干热大,三是湿热(de)蒸气有潜热存在.这种潜热,能迅速提高被灭菌物体(de)温度,从而增加灭菌效力.
培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以提供微生物生长发育所需(de)物质条件.培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基,培养放线菌常用高氏I号培养基,培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）,培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）.根据培养目(de)不同,可分为固体培养基和液体培养基；此外,还有加富、选择、鉴别等培养基之分.就培养基中(de)营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.琼脂（Agar）只是固体培养基(de)支持物,一般不为微生物所利用.它在高温下熔化成液体,而在45℃左右开始凝固成固体.在配制培养基时,根据各类微生物(de)特点,就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要(de)培养基. 培养基除了满足微生物所必需营养物质外,还要求有一定(de)酸碱度和渗透压.霉菌和酵母菌(de)pH偏酸；细菌、放线菌(de)pH为微碱性.所以每次配制培养基时,都要将培养基(de)pH值调到一定(de)范围.常用微生物培养基(de)配方如下：
LB培养基配方（pH ）：
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g
氯化钠（NaCl） 10.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
摇动容器直至溶质溶解,用5mol/L NaOH调pH至 ,用去离子水定容至1L,在压力下灭菌20min.
牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH）：
牛肉膏 3.0 g
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
NaCl 5.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
高氏I号培养基配方（pH ）：
可溶性淀粉 20.0 g
NaCl 0.5 g
KNO3 1.0 g
K2HPO43H2O 0.5 g
MgSO47H2O 0.5 g
FeSO47H2O 0.01g
琼脂粉（Agar） 20.0 g 去离子水 1000 mL
马铃薯培养基配方（自然pH）：
马铃薯（去皮） 200.0 g
葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
察氏培养基配方（自然pH）：
蔗糖（glucose） 30.0 g
NaNO3 2.0 g
K2HPO4 1.0 g
KCl 0.5 g
MgSO47H2O 0.5 g
FeSO47H2O 0.01 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
YPD培养基配方（pH ）：
酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g
蛋白胨（Peptone） 20.0 g
葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000mL
在压力下灭菌20min. 三、实验材料
牛肉膏蛋白胨、高氏I号、LB、PDA、YPD、察氏等各种培养基.
四、仪器设备及用具
1. 90mm培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH试纸（pH～）、记号笔、麻绳、纱布等；
2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅.
五、试剂
无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、NaCl、琼脂粉、5mol/L NaOH、1mol/L HCl、KNO3、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O等.
六、实验步骤
1．洗涤
用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次,控干水分.
注意事项：
①不能用有腐蚀作用(de)化学试剂,也不能使用比玻璃硬度大(de)物品来擦拭玻璃器皿；新(de)玻璃器皿应用2%(de)盐酸溶液浸泡数小时,用水充分洗干净.
②用过(de)器皿应立即洗涤.
③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道(de)物质不能直接倒在洗涤槽内,必须到在废物缸内. ④洗涤后(de)器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠.
2．器皿包扎
（1）培养皿：洗净(de)培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起,用牢固(de)纸卷成一筒,或装入特制(de)不锈钢桶中,然后进行灭菌.
（2）吸管：洗净,烘干后(de)吸管,在吸口(de)一头塞入少许脱脂棉花,以防在使用时造成污染.塞入(de)棉花量要适宜,多余(de)棉花可用酒精灯火焰烧掉.每支吸管用一条宽约4～5cm(de)纸条,以 30～50℃(de)角度螺旋形卷起来,吸管(de)尖端在头部,另一端用剩余(de)纸条打成一结,以防散开,标上容量,若干支吸管包扎成一束进行灭菌,使用时,从吸管中间拧断纸条,抽出吸管.
（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适(de)棉塞,棉塞可起过滤作用,避免空气中(de)微生物进入容器.制作棉塞时,要求棉花紧贴玻璃壁,没有皱纹和缝隙,松紧适宜.过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染.棉塞(de)长度不小于管口直径(de)2倍,约2/3塞进管口.若干支试管用绳扎在一起,在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸,再用绳扎紧.三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎.
3．烘干
洗净(de)仪器控去水分,放在烘箱内烘干,烘箱温度为 105～110℃烘1小时左右.此法适用于一般仪器.对于急于干燥(de)仪器或不适于放入烘箱(de)较大(de)仪器可用吹干(de)办法.通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分(de)仪器中摇洗,然后用电吹风机吹至完全干燥.不急等用(de)仪器,可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分,然后自然干燥.可用安有木钉(de)架子或带有透气孔(de)玻璃柜放置仪器.
4．培养基(de)配置 （1）牛肉膏蛋白胨培养基
A、称量
按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,也可按在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片.
蛋白胨很易吸湿,在称取时动作要迅速.另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净,擦干,再称取另一药品.瓶盖也不要盖错.
B、融化
在上述烧杯中先加入少于所需要(de)水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解.
将药品完全溶解后,补充水到所需(de)总体积,如果配制固体培养基时,将称好(de)琼脂放入己溶(de)药品中,再加热溶化,最后补足所损失(de)水分.
C、调节pH
在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基(de)原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达.反之,用1mol/LHCL进行调节.对于有些要求pH较精确(de)微生物,其pH(de)调节可用酸度计进行.pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子(de)浓度.配制pH低(de)琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解不能凝固.
