实验一培养基的配制与灭菌

实验一 培养基的配制及灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。

一、实验目的?

1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。

2．明确培养基的配制原理。?

3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。

4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。

二、实验原理

灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过?180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏?I?号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在?高温下熔化成液体，而在?45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的?pH?偏酸；细菌、放线菌的?pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的?pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：

实验一 菌种分离培养基的配制与灭菌

一、实验目的

学习并掌握菌种分离培养基的配制方法。

二、实验器材

1. 琼脂条、蔗糖或葡萄糖、马铃薯

2. 电炉、烧杯、试管、培养皿、玻棒、纱布、保鲜膜

三、实验方法

(一)菌种分离培养基的制备

称取营养成分→加热溶化→调整pH值→煮沸→过滤→分装→灭菌→无菌检验。

1. 根据所培养的真菌对营养元素的要求选择适当的配方。

2. 确定所需培养基的容量后，按配方称取药品和其它原料（一般用1/100感量的天枰即可），逐一加入水中加温溶解。

注意：

★最好先加无机药品，后加有机药品。难溶解的物质可先分别溶解后再加入。

★易受高温破坏的药品应单独配制，过滤灭菌，临用前加入培养基中

★若制备固体或半固体培养基，则需加入琼脂（固体培养基加1.8-2.0%的琼脂，半固体培养基加0.8-1.0%的琼脂），加热至琼脂融化，并补足由于蒸发失去的水分。琼脂加入后宜开锅搅拌，以防糊防溢。

3. 待配方中各成分全部溶解后，测试并调整培养基的pH值。对酸性培养基（pH<5），灭菌前不可加酸调节，须在灭菌后临用时加入或先将酸加入培养皿中，然后注入融化的培养基，以免在高温和酸性条件下琼脂水解而导致琼脂软化或完全失去凝固力。

4. 过滤

液体培养基用滤纸过滤，固体及半固体培养基用纱布夹药棉过滤，以制备清亮的培养基。

5. 分装

通过漏斗或虹吸管分装于三角瓶、试管或其它容器中。分装时严防培养基粘附在瓶口或管口，以避免培养基贮存或使用时的污染。 9. 灭菌

用高压蒸汽灭菌器灭菌

(二) 制作琼脂斜面

欲制作琼脂斜面，则在培养基灭菌后，趁热将试管置于木棒上，使试管成30°倾斜，而斜面总长度以不超过试管长度的1/2为宜，凝固后保存备用。

四、作业

固体、半固体和液体培养基有何不同，请详述马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基的配制过程。

本实验所用培养基：为最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基

实验四 培养基的配制与灭菌一、实验教学目标基本与要求1、明确培养基的配制原理。 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。3、熟悉准备微生物培养准备器械的方法二、实验内容1.　无菌移液管、无菌平皿，准备无菌水、棉塞（试管和在三角瓶）；2.　配制五类菌培养基(细菌、放线菌、霉菌、酵母培养基，双歧杆菌厌氧培养基)、分装。(每人参与配制一种，但要求四种都会配)3.　高压蒸汽灭菌，灭菌后摆放斜面；4.　实验室常用消毒灭菌方法(示范)。三、实验操作（一）吸管的包扎与灭菌：•在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。•棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑）；•然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。（二）培养皿的灭菌：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。（三）无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。1.无菌分离试管水的准备试管中装入4.5ml自来水，每组共准备12支，盖上塑料盖，包扎；2.三角瓶无菌水的准备三角瓶装入99ml水，共装3瓶，封口膜包扎，外包牛皮纸或报纸。3.无菌玻璃珠的准备三角瓶中装入玻璃珠，封口膜包扎，外包牛皮纸或报纸。（四）培养基的配制：1、标识同学们先将试管和三角瓶贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用记号笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 2、培养基的配制程序称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量自来水，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。定容：将溶化的培养基倒入量筒中，补充水量至所需体积；加琼脂溶化：加所需量的琼脂，加热融化并不断搅拌。3、培养基配方牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基)（1组）（p275） 牛肉膏0.5克，蛋白胨1克， NaCl 0.5克，水100mL，琼脂 2g ， pH7.2～7.4高氏一号培养基(常用的放线菌培养基)（2组）（p275） 可溶性淀粉2.0g， KNO300.1g ，K2HPO40.05g，MgSO40.05g，NaCl 0.05g，FeSO40.001g，水100mL，琼脂 2g ， pH7.2～7.4马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（3组）（p276） （用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下： 去皮马铃薯20g （或鲜豆芽10g），葡萄糖5g，自来水100mL ， 琼脂 2g ，pH 自然 。察氏培养基(常用的霉菌培养基)（4组）（p276）蔗糖3g，NaNO3 0.3g, KH2PO4 0.1g，KCl 0.05g，MgSO4 0.05g，FeSO4 0.001g，琼脂2g，自来水100mL ，pH 自然 。两歧双坡杆菌1.1852培养基（5组）（p281）大豆蛋白胨0.5g，胰胨0.5g，酵母提取物1.0 g，葡萄糖1g，CaCl2 0.02g，MGSO4 0.04g，K2HPO4 0.1 g，半胱氨酸盐酸盐0.05 g，蒸馏水100mL，pH7.2培养基配制注意事项 （1）若培养基中含有牛肉膏、酵母膏等非固体培养基，将基置于另一小烧杯中去皮称量后，加入少量蒸馏水中加热溶化，再倒入搪瓷杯溶液中。 （2）如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 （3）豆芽汁的制作：称取鲜黄豆芽，置于搪瓷杯中，加入配制水量，小火煮20-30min，纱布过滤，补足水分。（4）调pH。要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。（5）配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。五、培养基的分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。 分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积2/3。•每组同学为全班每位同学制备1支斜面（约4ml，按30人计，共120ml）•配制本班同学每人两块平板（每板约10ml，按30人计，共600ml ）•每组同学共需配制的培养基量为800ml•分装试管30支•余下培养基装入三角瓶中，分4瓶分装。1、斜面的分装与包扎斜面培养基的分装 按右图所示，将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1/5。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。2.试管的捆扎 包扎 每7-10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸或报纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名 。3、三角烧瓶的包装平板培養基平板培养基的制作只能用装在容器内进行灭菌后在使用时倒入平板。六、灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜。高压蒸汽灭菌锅的构造如右下图所示。2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。4.接通电源，进行加热。排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 5.当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持20min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 6.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。培养基配制 – 灭菌放入杀菌锅 (Autoclave) 灭菌注意事项 – 杀菌锅的使用滅菌結束後，等壓力降回零時才可打開門進入殺菌釜 之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套七、搁置斜面 当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的2/3。八、培养基的质量测试（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。九、培养基的保存 （1）基础培养基不能超过两周（2）生化试验培养基不宜超过一周（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用（4）倾注的平板培养基不宜超过3天。实验报告1.记录你所配制的培养基的名称、成分及称取量。2.记录培养基的配制及分装过程。

实验一 培养基的配制及灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。

一、实验目的

1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。

2．明确培养基的配制原理。

3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。

4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。

二、实验原理

灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过 180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏 I 号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在 高温下熔化成液体，而在 45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的 pH 偏酸；细菌、放线菌的 pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的 pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：