利用胶束在高浓度盐水环境下分离生物大分子的方案

反胶束萃取分离生物分子及相关领域的研究进展段金友　方积年3(中国科学院上海药物研究所,上海200031)摘　要　综述了反胶束有关的概念、理论;反胶束萃取蛋白质的传质机制、选择性分离过程及工艺流程;反胶束对氨基酸、抗生素及核酸的萃取分离;反胶束与其他方法、技术相结合的应用状况。

关键词　反胶束,萃取,分离,评述　2001202223收稿;2001206211接受1　引 言传统的液2液萃取分离技术成本低,易于运作,已广泛用于多组分物质的分离。

但是,由于缺乏相应的生化溶剂,采用该技术难以分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质;液相色谱技术,特别是制备型色谱技术的应用,使大多数生物分子的批量分离成为可能,然而由于该技术本身也存在某些局限性,例如一定的固定相,有时会引起目标物的不可逆吸附、甚至变性等现象,在一定程度上限制了其在生化工程中的应用。

近年来,以反胶束溶液为新的溶剂系统的萃取分离技术,可以选择性分离某些生物活性分子,而逐渐引起了人们的重视。

1977年Luisi 等1首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含双亲物质(表面活性剂)的有机溶剂中,超离心数据显示有机相中有反胶束的存在,同时,光谱分析(紫外2可见光谱、荧光光谱、旋光光谱)表明这一过程未引起酶的变性;1979年Luisi 等2考察了蛋白质溶液的pH 值、蛋白质和双亲物质的浓度对蛋白质萃取率的影响及蛋白质在反胶束溶液中的光谱特性;1979年Menger 和Y amada 3对反胶束溶液中酶的性质进行了研究。

随后的20多年里,反胶束萃取技术已广泛应用于蛋白质的分离和纯化,并逐渐延伸至其他生物分子(氨基酸、抗生素、核酸)的分离研究;近年来,该技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发,显示了良好的应用前景。

2　反胶束的定义、形成条件、特征和研究方法反胶束(reversed micelle )是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体,又称为反胶团、逆胶束(inverse micelle )4,5。

生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。

它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。

本文将着重探讨的原理、方法和应用。

一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。

为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。

例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。

还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。

二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。

它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。

根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。

2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。

根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。

3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。

超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。

4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。

5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。

三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。

具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。

这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。

如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案一、通用的技术路线设计方案：1、确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。

本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。

2、建立相应可靠的分析测定方法分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。

没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。

3、查阅文献调研和预备性实验要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。

4、生物材料的破碎和处理需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。

5、分离纯化方案的选择和探索同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。

而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。

所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。

6、生物大分子纯度的检测根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。

7、产物的浓缩、干燥与保存二、常用的检测方法：1、物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。

但应注意，必须同时采用 2～3 种不同的纯度鉴定法才能确定。

2、生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；三、要了解的主要理化性质：1、在水和各种有机溶剂中的溶解性。

盐溶度，即盐在水中的溶解度，是影响胶束（胶体束）性质的重要因素之一。

盐溶度对胶束的影响主要体现在以下几个方面：
1.电荷中和：许多胶体粒子带有电荷，这些电荷来源于胶体表面的离子化或吸附的离子。

盐溶解在水中后，会电离出正负离子，这些离子可以与胶体粒子表面的电荷发生中和作用。

当盐的浓度增加时，更多的离子与胶体粒子发生电荷中和，导致胶体粒子之间的静电斥力减弱，从而易于聚集形成更大的胶束。

2.双电层压缩：胶体粒子在水中形成双电层结构，即粒子表面带有一层电荷，周围则分布着相反电荷的离子（反离子）。

随着盐浓度的增加，反离子更容易进入双电层，从而压缩双电层，使胶体粒子之间的斥力减小，易于聚集。

3.渗透压效应：当盐浓度增加时，渗透压也会相应增加。

这可能导致胶体粒子内的水分被吸出，使胶体粒子体积减小，进而影响胶束的稳定性。

4.盐析效应：某些胶体在高盐浓度下会发生盐析现象，即胶体粒子从溶液中析出，形成沉淀。

这会导致胶束的稳定性降低，甚至完全破坏。

综上所述，盐溶度对胶束的影响是多方面的，包括电荷中和、双电层压缩、渗透压效应和盐析效应等。

这些效应共
同作用，使胶束的稳定性、大小和形态等性质发生变化。

因此，在研究和应用胶体体系时，需要充分考虑盐溶度的影响，以便更好地理解和控制胶束的性质。

生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。

纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。

本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。

一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。

通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。

这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。

2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。

常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。

3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。

二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。

2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。

3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。

三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。

2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。

3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。

结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。

选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。

第一章绪论复习题1.生物分离工程在生物技术中的地位？在生物技术领域，一般将生物产品的生产过程称为生物加工过程，包括优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等）及目标产物的分离纯化过程，后者又称为下游加工过程。

生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性。

因此导致下游加工过程的成本往往占整个生物加工过程成本的大部分。

生物分离工程研究的根本任务：设计和优化分离过程，提高分离效率，减少分离过程步骤，缩短分离操作时间，达到提高海口收率与活性、降低生产成本的目的。

生物分离工程的特点是什么？1．产品丰富，产品的多样性导致分离方法的多样性2．绝大多数生物分离方法来源于化学分离3．生物分离一般比化工分离难度大3.生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？生物分离过程一般分四步：1.固-液分离（不溶物的去除）离心、过滤、细胞破碎目的是提高产物浓度和质量2.浓缩（杂质粗分）离子交换吸附、萃取、溶剂萃取、反胶团萃取、超临界流体萃取、双水相萃取以上分离过程不具备特异性，只是进行初分，可提高产物浓度和质量。

3．纯化色谱、电泳、沉淀以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性。

4．精制结晶、干燥在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？（1）产品价值（2）产品质量（3）产物在生产过程中出现的位置（4）杂质在生产过程中出现的位置（5）主要杂质独特的物化性质是什么？（6）不同分离方法的技术经济比较上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化。

5.生物分离效率有哪些评价指标？目标产品的浓缩程度——浓缩率m2．目标产物的分离纯化程度——分离因子或分离系数α3．回收率REC第二章细胞分离与破碎复习题1．简述细胞破碎的意义一、细胞破碎的目的由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物，然后方可进行提取。

生物大分子的分离和分析方法生物大分子是指体积较大且化学性质复杂的生物分子，包括蛋白质、核酸、多糖等。

这些分子在生命体系中发挥着重要的生物学功能，同时也是医药研究、生物技术和食品科学等领域的关键研究对象。

因此，分离和分析生物大分子的方法对于各个领域的研究都具有重要意义。

一、生物大分子的分离方法1. 溶液层析法溶液层析法是一种基于分子大小、形状、电荷或亲和力差异的分离方法。

该方法通常使用大小不同的孔径柱、离子交换柱或亲和性柱等进行分离。

在溶液层析法中，溶液流经柱子，分离成不同的组分通过吸附、脱附等机制分离。

2. 凝胶电泳法凝胶电泳法是一种将带电分子分离的方法。

该方法基于分子大小、电荷、形状等差异，借助电力场将不同大小的分子带到凝胶中的不同位置，从而实现分离。

凝胶电泳法可用于分离蛋白质、核酸、多糖等分子。

3. 超速离心法超速离心法是基于生物大分子在其受到离心力的作用下，按照不同的密度离心分离的方法。

通过调整离心条件，可以分离不同的组份。

该方法主要用于分离蛋白质、核酸和细胞等生物大分子。

二、生物大分子的分析方法1. 光谱学分析法光谱学分析法是一种通过检测分子与辐射能量之间的相互作用来进行分析和识别的方法。

常用的光谱学分析方法包括红外光谱、紫外光谱、拉曼光谱、荧光光谱、核磁共振和质谱等方法。

通过这些技术，可以研究生物大分子的结构、构象、原子排布以及化学反应机制等。

2. 生化分析法生化分析法是一种通过检测分子之间的相互作用和反应来进行分析和识别的方法。

常用的生化分析方法包括酶反应测定、免疫反应测定、亲和力层析、光化学反应测定等。

通过这些技术，可以研究生物大分子的活性、亲和性、代谢路线、分子间相互作用等。

3. 生物计量学分析法生物计量学分析法是一种通过检测生物分子在其受到离心力作用下的沉降速度来进行分析和识别的方法。

常用的生物计量学分析方法包括蛋白质浓度测定、核酸浓度测定、细胞计数、分子质量测定等。

通过这些技术，可以研究生物大分子的组成、浓度、分子质量等。

生物大分子的分离与分析技术生物大分子是生命体系中不可或缺的组成部分，如DNA、RNA、蛋白质等。

它们的结构复杂，分子量高，充满了不同的功能和生物活性。

因此，对这些生物大分子的研究成为了当今生命科学领域的一个热点。

而要进行这样的研究，首先就需要对这些生物大分子进行分离与分析，以便更深入地了解其性质和功能。

分离技术1.凝胶电泳凝胶电泳是一种广泛应用于生物大分子分离与分析的技术。

其基本原理是将待分离的生物大分子样品被限制在凝胶基质中，然后通过电场将分子向着电极移动，根据大小、形态、电荷密度等特性将分子分离出来。

其中最常用的凝胶基质包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺-琼脂糖双层凝胶等。

凝胶电泳可以有效分离DNA、RNA、蛋白质或其他生物大分子，且成本低、可重复性好，因此在生命科学研究中得到了广泛应用。

2.离心离心技术是一种通过重力势能的差异用于分离生物分子的技术。

在离心过程中，待分离的生物分子样品可被置于离心管中，借助离心机的高速旋转，生物分子会在离心管中沉淀或浮起来，从而在不同位置分离出来。

针对不同的生物分子，可选择不同的离心条件，如离心速度和时间等。

离心技术广泛应用于细胞分离以及蛋白质等生物分子纯化的过程中。

分析技术1.质谱分析质谱分析是一种用于分析生物分子共价和非共价结构的技术，主要是将待分析样品分子通过鉴定质量-电荷比（m/z）的德技术，得到该分子的分子量以及结构信息。

在生命科学中，常用的质谱分析技术包括飞行时间质谱、电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离质谱等。

质谱分析技术可进行非常精确的定量分析和离子结构分析，因此在生物分子研究的分析过程中得到了广泛应用。

2.核磁共振核磁共振（NMR）是一种常用于分析与结构生化过程相关的生物分子的技术。

通过将待分析样品暴露在恒定的磁场下，然后利用外界的电磁波辐射的方式来激发样品内原子的核自旋，进而和分析核自旋之间的相互作用信息，在检测器中得到相应的能谱，最终得到该分子的结构信息。

分离纯化、复习题库⼀、名词解释1、凝聚：凝聚是指在某些电解质作⽤下，破坏细胞、菌体和蛋⽩质等胶体粒⼦的分散状态，使胶体粒⼦聚集的过程。

2、固液分离：是将发酵液（或培养液、提取液等）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎⽚以及蛋⽩质等的沉淀物或它们的絮凝体分离出来的操作过程。

3、双⽔相萃取：利⽤物质在互不相溶的两⽔相间分配系数的差异来进⾏萃取的⽅法。

4、超临界流体萃取：是利⽤超临界流体作为萃取剂，对物质进⾏溶解和分离的过程。

5、盐析法：在⾼浓度的中性盐存在下，蛋⽩质（酶）等⽣物⼤分⼦物质在⽔溶液中的溶解度降低，产⽣沉淀的过程。

6、重结晶：是利⽤杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体⽤合适的溶剂再次结晶，以获得⾼纯度的晶体的操作。

7、浓缩：浓缩是低浓度溶液通过除去溶剂（包括⽔）变为⾼浓度溶液的过程。

8、等电点沉淀法：调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。

9、分配⾊谱法：分配⾊谱法是靠溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同⽽分离的⾊谱⽅法。

10、离⼦交换⾊谱法：是利⽤具有离⼦交换性能的离⼦交换剂作固定相，利⽤它与流动相中的离⼦能进⾏可逆交换的性质来分离离⼦型化合物的⾊谱⽅法。

11、膜分离技术：利⽤膜的选择性（孔径⼤⼩），以膜的两侧存在的能量差作为推动⼒，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同⽽实现分离的⼀种技术。

⼆、填空题1、按料液的流动⽅向不同，过滤可以分为常规过滤和错流过滤。

2、常⽤的浸取⽅法有浸渍法、煎煮法和渗漉法三种。

3、超临界流体萃取根据分离条件不同，可分为等温变压法、等压变温法、吸附法三种典型流程。

4、⼤多数⽣物产品的分离纯化过程按⽣产过程的顺序⼤致可分为预处理和固液分离、提取(初步分离) 、精制(⾼度纯化) 和成品制作四个类似步骤。

5、⼯业上⼤规模⽣产中应⽤最多的细胞破碎⽅法主要有⾼速珠磨法和⾼速匀浆法。

6、⼯业中常⽤的离⼼分离设备有管式离⼼机、碟⽚式离⼼机、倾析式离⼼机。