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孕马尿中3种主要结合雌激素含量一测多评新方法研究姚军;李东雨;张煌涛;鹿毅;高晓黎【摘要】建立基于质谱检测的一测多评(QAMS)测定孕马尿中3种主要结合雌激素方法.样品经大孔吸附树脂固相萃取小柱净化,利用HPLC-MS进行检测,以雌酮硫酸钠为内标,测定马烯雌酮硫酸钠及17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的相对校正因子,进行3种成分的含量测定.结果表明,3种成分的线性、精密度、稳定性及回收率均较好.马烯雌酮硫酸钠及17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的相对校正因子分别为0.8663和0.9884.色谱柱、碎片电压等均对校正因子影响较小,两种方法测定10批孕马尿样品中的3种结合雌激素含量,无显著性差异,该方法在测定孕马尿中3种主要结合雌激素方面有更大的优势.【期刊名称】《中国测试》【年(卷),期】2015(041)010【总页数】5页(P58-62)【关键词】结合雌激素;一测多评;LC-MS;相对校正因子【作者】姚军;李东雨;张煌涛;鹿毅;高晓黎【作者单位】新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830054;新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院,新疆乌鲁木齐830004;新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830054;新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院,新疆乌鲁木齐830004;新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院,新疆乌鲁木齐830004;新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830054【正文语种】中文孕马结合雌激素作为激素补充疗法（hormonere placement therapy，HRT)的重要药物已经得到普遍应用[1]，惠氏制药公司生成的倍美力、倍美安、倍美盈等药物中雌激素均为从孕马尿中获得。
孕马雌激素是一类雌激素硫酸钠盐的混合物，被称为结合雌激素（conjugated estrogens，CE)，种类较多，其中以雌酮硫酸钠（sodium estrone sulfate，ES)、马烯雌酮硫酸钠（sodium equilin sulfate，EqS)、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠（sodium 17α-dihydroequilin sulfate，17α-EqS)为主，3者占结合雌激素总含量的90%以上，这3种成分是美国药典及欧盟药典作为孕马CE药物含量测定的质控成分[2]。
孕马尿提取物中4种化学成分的雌激素活性研究毛旭文;张莉;杜冠华;高晓黎【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2015(000)009【摘要】目的：研究孕马尿提取物中4种化学成分的雌激素活性。
方法研究4种成分3β-羟基-5α-16-孕甾烷-20-酮（3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one，HP ）、5β-孕甾烷-3β，16α，20α-醇（5β-pregnane-3β，16α，20α-triol，PT）、3β，16α-脱氢-5α-孕甾烷-20-酮（3β，16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one， DHP）、3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮（3β-hydroxy-5α-androstan-17-one，HA）对人乳腺癌细胞 MCF-7的细胞增殖效应（E-screen 实验）；利用 Luciferase 报告基因与雌激素反应元件重组，与转染对照质粒 pRL-cmv、雌激素受体 E Rα或ERβ质粒共同瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞 CHO，构建雌激素活性筛选模型，检测四种成分的雌激素活性。
结果E-screen 实验结果显示，HP、PT、DHP、HA 在1～50μmol·L －1内均能诱导MCF-7细胞增殖，显示出雌激素活性。
与雌二醇（17α-estro-diol，E2）的增殖效应（proliferative effect，PE）、相对增殖效应（relative proliferative effect，RPE）和EC50相比，HP、PT、DHP、HA 的雌激素活性均小于 E2的雌激素活性。
Luciferase 报告基因实验结果显示，HP、PT、DHP、HA 在1～50μmol·L －1内均能诱导 Luciferase 表达，显示雌激素活性。
与 E2的 EC50值相比，HP、PT、DHP、HA 的雌激素活性均弱于 E2的雌激素活性。
结论HP、PT、DHP、HA 均具有雌激素活性，与 E2的雌激素活性相比，四种化合物均发挥弱雌激素效应。
孕马尿中雌激素成分的研究木拉塔力·克力木;高晓黎;肖健民;徐智勇;尚军【摘要】目的:了解孕马尿液中主要雌激素成分雌酮硫酸钠,马烯雌酮硫酸钠及17α-二氢马烯雌酮硫酸钠浓度在孕马孕期不同阶段浓度变化趋势,为孕马尿收集时间的选择提供科学依据.方法: 相同孕期、相同品种的9匹怀孕母马自怀孕20周～44周,隔2周连续采集尿样,采用高效液相色谱 (HPLC)法测定尿液中结合雌激素成分的含量,比较各成分浓度变化情况,并做出含量变化趋势图.结果: 雌酮硫酸钠在孕马怀孕22周尿液中浓度达到最高水平,自怀孕22周～44周呈现逐渐下降的趋势,马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠在采集开始阶段浓度较低,随着怀孕时间延长浓度逐渐上升,到怀孕32周达到最高值后逐渐下降.结论: 母马在孕期中形成的结合雌激素含量存在较大的个体差异,雌酮硫酸钠在母马怀孕22周尿液中浓度达到最高峰,马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠浓度在母马怀孕32周尿液中浓度达到最高值.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2009(032)004【总页数】3页(P403-405)【关键词】孕马尿;结合雌激素;变化趋势【作者】木拉塔力·克力木;高晓黎;肖健民;徐智勇;尚军【作者单位】新疆医科大学药学院药剂教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学药学院药剂教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆特丰药业股份有限公司,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆特丰药业股份有限公司,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆特丰药业股份有限公司,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R335孕马尿中富含雌激素，每升孕马尿中雌激素的平均含量在70～130 mg,每匹孕马在孕期内可形成雌激素50～100 g,可以充分利用孕马尿来提取天然雌激素[1]。
结合雌激素是从孕马尿中提取的一种天然混合雌激素,临床上主要用于激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy, HRT)，以缓解任何因雌激素不足引起的临床症状[2]。
孕马尿中主要结合雌激素的TLC定性鉴别
姚军;任丽君;李敏;高晓黎
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2015(000)007
【摘要】为了建立薄层色谱法快速评价新疆孕马尿中结合雌激素品质的方法,将孕马尿样品采用大孔吸附树脂固相萃取进行前处理,薄层板为硅胶G板(20×10 cm),展开剂为乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇(30∶90∶22,体积比),显色剂为20％的硫酸乙醇溶液.孕马尿中3种主要结合雌激素在薄层板上呈现蓝绿色斑点,尿中其他杂质无干扰.建立的薄层色谱法能够对孕马尿中主要结合雌激素快速鉴别,可用于孕马尿结合雌激素品质评价.
【总页数】3页(P147-149)
【作者】姚军;任丽君;李敏;高晓黎
【作者单位】新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830011;新疆昌吉职业技术学院药学院,新疆昌吉831100;新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830011;新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830011
【正文语种】中文
【中图分类】S857.2+2
【相关文献】
1.孕马尿中3种主要结合雌激素含量一测多评新方法研究 [J], 姚军;李东雨;张煌涛;鹿毅;高晓黎
2.对孕马尿液提取结合雌激素后的工业废水处理技术探讨 [J], 濮军文
3.从孕马尿中提取分离结合雌激素的方法研究进展 [J], 孔金金;高晓黎
4.论马产品产业化发展前景——以伊犁州直属县孕马尿结合雌激素产业化现状为例[J], 甫拉提江·艾力皮别克;王骁;努里木江·叶尔哈力
5.TLC法定性鉴别孕坤通胶囊中4味中药 [J], 孙翠;文志云;宋志钊;李星宇;刘元因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
从孕马尿中提取分离结合雌激素的方法研究进展【关键词】结合雌激素；孕马尿；提取分离；研究进展结合雌激素是从孕马尿中提取的一种天然混合雌激素。
结合雌激素类药物主要用于激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy ，HRT），用于缓解任何雌激素不足的临床症状，治疗和预防女性生理或人工绝经后出现的更年期综合症，能够预防和治疗骨质疏松症和冠心病。
孕马尿中的化学成分复杂，要从孕马尿中提取分离有效成分，即结合雌激素，必须要借助于不断发展的提取分离技术，然而提取分离技术的发展过程往往也是提取设备以及分离材料多元化、现代化的过程。
从20世纪30年代至今，结合雌激素的提取分离研究一直是国内外的研究热点，已有大量的专利公开和文献报道。
本文就前人所做的关于结合雌激素提取分离的研究和工作进行以下总结。
1孕马结合雌激素提取与分离方法研究进展1.1液-液溶剂萃取法液-液溶剂萃取法是利用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而达到分离的方法[1] 。
1938年，Schachter B与Marrian GF[2]等人采用溶剂萃取法从孕马尿中分离出了硫酸盐结合雌激素。
2004年4月15日Gerling Klaus-Guenter和Ban Ivan [3]等人公开了一种利用液-液提取系统获得天然结合雌激素并同时去除非结合态的亲脂性化合物，如：非结合态类黄酮，非结合态异黄酮以及非结合态甾体类化合物。
1.2沉淀法沉淀法是在天然产物的提取物中加入某些试剂使其析出其中某种或某些成分，或析出其杂质，产生沉淀，以获得有效成分或去除杂质的方法[1]。
Russell E，Marker，[4-5]等人于1937～1938年间研究了孕马尿中孕激素和尿甾激素及其衍生物。
他们采用了古老而又经典的沉淀结晶法分离出除了雌激素以外的孕二醇，孕二酮，别孕二醇等尿甾激素。
1.3柱分离法1.3.1大孔吸附树脂的应用大孔吸附树脂[1]是20世纪60年代初开发出的一类新型高分子分离材料，它是一种高聚物吸附剂，根据其孔径、比表面积及构成类型分为许多型号。
对孕马尿液提取结合雌激素后的工业废水处理技术探讨濮军文【摘要】对新疆新姿源生物制药有限公司利用孕马尿生产结合雌激素工业化生产过程中排放的高盐、高氨氮(NH3-N)、高化学需氧量(CODcr)工业废水进行处理,通过几种工艺方案实验比较,确定出最佳的工艺方案.当原水CODcr,SS,NH3-N的浓度分别为50000mg/L,500mg/L,7000mg/L时,经处理后出水CODcr,SS,NH3-N的浓度分别为60mg/L,5mg/L,5mg/L,可达到《污水综合排放标准》(GB8978-1996)中的一级标准.【期刊名称】《低碳世界》【年(卷),期】2015(000)034【总页数】2页(P1-2)【关键词】孕马尿;生产废水;处理效率【作者】濮军文【作者单位】南京东大能源工程设计院有限公司,江苏南京210018【正文语种】中文【中图分类】TQ464孕马尿中富含雌激素，每升孕马尿中雌激素的平均含量在70～130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素50～100g，可以充分利用孕马尿来提取天然雌激素[1]。
随着孕马结合雌激素生物制药生产规模的不断扩大，孕马尿生产结合雌激素工业化生产过程中排放的高盐、高氨氮、高COD工业废水已不容小觑，远不能达到排放标准。
新疆新姿源生物有限责任公司作为该产业的一员，原有处理能力88.3m3/d 的污水处理设施，但已不能满足日益增长的排放需求，为保证花园式厂区建设宗旨，维护绿色生态环境，本公司通过对原水水质水量的深度分析，并通过实验室小试形成对孕马结合雌激素生产废水处理的专有技术，以COD、SS及NH3-N为主要评价指标，验证该方案的可行性，为实现环保装置的清洁生产及副产品循环利用，实现孕马结合雌激素生物制药工业化生产的循环经济模式奠定基础。
1.1 废水水质、水量及排放要求根据企业提供的数据，处理水量为Q=36000m3/a，按污水处理设备一年300d每天运行24h计，本方案设计按120t/d计算，即约5t/h设计，废水水质见表1。
影响妊娠伊犁马结合雌激素浓度的因素分析郭海娟;王旭光;孟军;刘运飞;邓海峰;罗俊;姚新奎【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(41)7【摘要】试验通过分析伊犁母马妊娠时间、年龄和尿量对伊犁马孕马尿中结合雌激素浓度的影响,以期为企业生产动物结合雌激素提供参考.选取相同饲养条件下妊娠期为28～38周伊犁孕马35匹并按年龄分为3组,每周采尿样1次并记录24 h 尿量.高效液相色谱(HPLC)法测定结合雌激素的浓度.采用SAS 8.1最小二乘法分析妊娠时间、年龄因素对结合雌激素浓度的影响;相关分析法分析尿量与结合雌激素浓度的相关性.结果显示,妊娠时间对结合雌激素浓度有极显著影响(P＜0.01).年龄对17α-双氢马烯雌酮硫酸钠浓度影响不显著(P＞0.05);年龄对雌酮硫酸钠浓度和马烯雌酮硫酸钠浓度影响极显著(P＜0.01).尿量与17α-双氢马烯雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠浓度呈极显著负相关(P＜0.01);尿量与雌酮硫酸钠浓度呈不显著负相关(P＞0.05).结果表明,伊犁孕马妊娠时间是影响结合雌激素浓度的关键因素;采集尿液的伊犁孕马年龄不宜超过13岁;伊犁孕马尿液中结合雌激素浓度与孕马尿量呈极显著负相关.【总页数】5页(P197-201)【作者】郭海娟;王旭光;孟军;刘运飞;邓海峰;罗俊;姚新奎【作者单位】新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;昭苏马场,新疆昭苏835600;新疆新姿源生物制药有限责任公司,新疆新源835800;新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】S821.2【相关文献】1.不同消化能/粗蛋白质水平日粮对伊犁马妊娠后期及分娩后血液理化指标的影响[J], 王贤东;邓海峰;靳伟星;陈鳌;漆雯雯;张浩;于全平;陈勇2.饲粮不同营养水平对伊犁马妊娠后期体重、消化代谢及分娩后初乳成分的影响[J], 王贤东;于全平;方美烟;杨光;陈勇3.论马产品产业化发展前景——以伊犁州直属县孕马尿结合雌激素产业化现状为例[J], 甫拉提江·艾力皮别克;王骁;努里木江·叶尔哈力4.围产期补喂L-精氨酸对伊犁马母马血液参数、妊娠率、返情率及新生马驹生长的影响 [J], 刘保宣;李晓斌;徐浩;李宁;李凤鸣;臧长江5.补喂亮氨酸对伊犁马血浆氨基酸及其主要相关代谢物浓度的影响 [J], 艾毕肯;杨开伦;赖晓鹤;张文杰;韩明;刘律;张仕琦;郑文祥;欧阳文;祁居中因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
TLC,LTD,SurestepTM三种尿吗啡定性检测方法的对比研究苏木金;张豫
【期刊名称】《现代诊断与治疗》
【年(卷),期】1997(008)006
【摘要】比较薄层色谱法，改良纸薄层色谱法和一步法对海洛因依赖者尿吗啡定性检测的敏感性。
方法３０例海洛因依赖者脱毒过程中逐日尿液标本采用该三种方法进行检测，并以３０名健康者尿淮标本作对照。
结果３０名健康者尿淮标本吗啡定性检测三种方法均呈阴性。
【总页数】2页(P331-332)
【作者】苏木金;张豫
【作者单位】解放军广州疗养院;解放军广州疗养院
【正文语种】中文
【中图分类】R163
【相关文献】
1.三种检测尿中吗啡方法的比较分析 [J], 陆敏珏
2.尿中吗啡常见检测方法 [J], 吕海茹
3.阿片类成瘾者血清、尿中吗啡TLCS分析 [J], 王玉瑾;张加玲;刘燕娥;王建伟
4.三种检测尿中吗啡方法的比较分析 [J], 陆敏珏;向平
5.三种高含量过氧化氢消毒剂体系的配方稳定性及检测方法对比研究 [J], 马杰;卢隆峰
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孕马尿中主要结合雌激素的TLC定性鉴别作者：姚军任丽君李敏等来源：《安徽农业科学》2015年第07期摘要为了建立薄层色谱法快速评价新疆孕马尿中结合雌激素品质的方法，将孕马尿样品采用大孔吸附树脂固相萃取进行前处理，薄层板为硅胶G板（20×10 cm），展开剂为乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（30∶90∶22，体积比），显色剂为20%的硫酸乙醇溶液。
孕马尿中3种主要结合雌激素在薄层板上呈现蓝绿色斑点，尿中其他杂质无干扰。
建立的薄层色谱法能够对孕马尿中主要结合雌激素快速鉴别，可用于孕马尿结合雌激素品质评价。
关键词结合雌激素；孕马尿；薄层色谱法；质量控制中图分类号S857.2+2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-147-03女性进入更年期，激素分泌急剧减少甚至不再分泌，激素的减少将严重影响妇女生理及心理健康。
如果不予以重视和治疗，将会大大增加更年期症状。
雌激素补充疗法作为治疗妇女更年期综合征的方法之一，在预防绝经后骨质疏松[1]、冠心病[2]及阿尔兹海默症[3]方面起着非常重要的作用。
怀孕母马的尿液中富含雌激素，每匹孕马在孕期内可形成雌激素50～ 100g[4]。
这些雌激素是一类结构较为相似的甾体化合物，在马尿中它们多以硫酸钠盐形式结合，因此称为结合雌激素（Conjugated estrogens，CE）。
其中，雌酮硫酸钠（Sodium estrone sulfate，ES）、马烯雌酮硫酸钠（Sodium equilin sulfate，EqS）及17α双氢马烯雌酮硫酸钠（Sodium 17α-dihydroequilin sulfate，17α-EqS）是其中最主要的成分，占孕马结合雌激素总含量的90%以上，成为孕马结合雌激素指标性成分。
惠氏公司从20世纪40年代就开始从孕马尿中提取结合雌激素，作为更年期妇女雌激素补充疗法的药物，结合雌激素一直作为妇女雌激素补充疗法的主要药物。
新疆地区具有极其丰富的牧业资源，其中伊犁河谷是目前世界上马匹最集中的地区之一，不仅数量多，而且伊犁马的优良品质扬名海内外。
根据《新疆统计年鉴（2011）》有关数据[5]可知，截止2010年年底新疆马匹存栏量为85.29万匹，其中伊犁哈萨克自治州为新疆马匹的集中分布区，其马匹存栏量为56.04万匹，占新疆马匹存栏总量的65.71%。
目前，已有不少制药企业从孕马尿中提取结合雌激素研发新的雌激素药物，但由于孕马资源属于当地牧户，在收购马尿时需要对孕马尿品质进行评价，因此建立简便易行的检测方法就显得至关重要。
目前，已经建立了银化硅胶板分离孕马结合雌激素的方法，但是由于银化硅胶板中的银离子极易氧化，实际操作中仍存在诸多问题，难以实际应用[6]。
笔者建立了孕马尿3种主要CE的TLC快速定性方法，可用于孕马尿中结合雌激素品质的快速定性检测。
1材料与方法1.1材料1.1.1仪器。
薄层色谱仪（包括CAMAG LINOMAT5自动点样器、CAMAG REPROSTAR3成像系统、CAMAG ADC2自动展开系统，瑞士卡玛公司）；AB135-S电子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；高速冷冻离心机（HERAEUS MULTIFUGE X3R，美国Thermo scientific公司）；恒温真空干燥箱（型号DZF-6090，购自上海一恒科学仪器有限公司）。
1.1.2试剂。
ES、EqS及17α-EqS对照品（新疆新姿源生物制药公司提供，含量≥99.0%）；薄层色谱法所用甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷、乙醇、氢氧化钠、氯化钠、硫酸均为分析纯；HPD-400大孔树脂（上海摩速公司）；硅胶G板（20×10 cm）（青岛海洋公司）。
1.1.3试验材料。
采集的孕马尿样品均来自新疆伊犁州新源县土尔根乡牧户，批号分别为201301、201302、201303、201304、201305、201306、201307、201308、201309，以上9批为怀孕母马尿液；批号分别为201310、201311、201312、201313为未怀孕母马尿液。
1.2方法1.2.13种CE对照品溶液的制备。
精确称取ES、EqS和17α-EqS对照品各20.0、10.0和7.5 mg，分别置于100 ml的容量瓶中，加入甲醇-水（50∶50）溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成ES、EqS、17α-EqS的浓度分别为200、100和75 μg/ml的储备液。
分别精密量取上述3种对照品储备液2.0 ml置于10 ml容量瓶中，以甲醇-水（50∶50）溶剂定容，得到3种CE浓度分别40、20和15 μg/ml混合对照品溶液。
1.2.2显色剂溶液的配制。
量取200 ml浓硫酸溶液，溶于乙醇中，最终定容至1 L，摇匀后得到浓度约为20%的硫酸乙醇溶液。
1.2.3孕马尿样品的处理。
1.2.3.1稀释直接点样。
取马尿10 ml，以5 000 r/min离心5 min，取上清液稀释5倍，点样。
1.2.3.2液液萃取处理。
取马尿10 ml，以5 000 r/min离心5 min，取上清液5 ml，加入0.5 g NaCl固体，分别加入10 ml和15 ml乙酸乙酯萃取2次，每次涡旋5 min合并乙酸乙酯层，摇匀，点样。
1.2.3.3固相萃取前处理。
5 ml注射器管，用一筛板置于出口处，取HPD-400大孔吸附树脂1.0 g，干法装填，装填体积约2 ml。
活化方法：先用5 ml无水乙醇活化，然后用5 ml纯水在重力作用下洗脱。
取孕马尿5 ml于高速离心机5 000 r/min离心5 min，准确量取上清液1.0 ml，缓慢滴入固相萃取小柱中，用5%NaCl溶液4 ml清洗，再用1.5%NaOH溶液4 ml清洗，弃去清洗液，再用无水乙醇洗脱并收集流出液至5 ml，摇匀，作为薄层色谱方法供试品，清洗和洗脱步骤均在重力作用洗脱。
1.2.3.4薄层色谱条件。
薄层板：硅胶G板（20×10 cm）；展开剂：乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（体积比30∶90∶22）；点样量为20 μl，点样宽度3 mm；展开方式：利用自动展开系统，3次增量展开（即展开至硅胶板的1/3、2/3处时取出凉风吹干，放入缸中继续展开）；显色方式：浸入法显色；于105 ℃加热5 min后置于成像系统中紫外灯365 nm处检视。
2结果与分析2.1 样品前处理方法的考察分别进行了稀释直接点样、液液萃取、固相萃取3种前处理方法的考察，3种方法处理的样品的TLC图谱见图1～3。
注：1～3分别为ES、EqS、17α-EqS对照品溶液；4～12为孕马尿供试品；13～16分别为阴性样品。
图1 马尿稀释后直接点样TLC注：1～3分别为ES、EqS、17α-EqS对照品溶液；4～12为孕马尿供试品；13～16分别为阴性样品。
图2孕马尿液液萃取后TLC注：1～3分别为ES、EqS、17α-EqS对照品溶液；4～12为孕马尿供试品；13～16分别为阴性样品。
图3 孕马尿固相萃取TLC从图1～3可以看出，大孔吸附树脂固相萃取前处理方法在除杂方面的效果较好，薄层色谱图中有效成分斑点清晰，杂质无干扰。
因此，选择大孔吸附固相萃取方法作为TLC前处理方法。
2.2薄层展开剂的考察薄层展开剂1为乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（体积比30∶90∶22），图3中采用的为此展开剂；薄层展开剂2为乙酸乙酯-二氯乙烷-甲醇（体积比35∶65∶20），其色谱情况见图4；薄层展开剂3为乙酸乙酯-氯仿-正丁醇（体积比35∶50∶15），其色谱情况见图5。
注：1～3分别为ES、EqS、17α-EqS对照品溶液；4～12为孕马尿供试品；13～16分别为阴性样品。
图4乙酸乙酯-二氯乙烷-甲醇（体积比35∶65∶20）条件下孕马尿的TLC注：1～3分别为ES、EqS、17α-EqS对照品溶液；4～12为孕马尿供试品；13～16分别为阴性样品。
图5乙酸乙酯-氯仿-正丁醇（体积比35∶50∶15）条件下孕马尿的TLC采用不同展开系统，只能将3种结合雌激素中的17α-EqS与ES、EqS在薄层板上分开，但由于ES、EqS结构极为相似，因此在硅胶板上无法分开。
通过上述3种薄层展开剂的TLC图谱比较，薄层展开剂1乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（体积比30∶90∶22）的分离情况较好，因此选择薄层展开剂1作为TLC展开剂（图3～5）。
3小结孕马尿中结合雌激素品质评价是结合雌激素药物研发的原料采购环节的重要一环，由于需要检测的孕马尿样品数目大、样品中结合雌激素含量差异大，建立快速、简便和低成本的孕马尿检测方法尤为重要。
建立的孕马尿中结合雌激素薄层快速定性方法，能够有效区分怀孕母马尿液与未怀孕母马尿液，并能够根据斑点颜色深浅评价结合雌激素品质，为收购孕马尿提供一种快速鉴别的方法。
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