125I标记单克隆抗体技术

抗人CD40 mAb 5H6的125I标记及其与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：罗先富, 章斌, 马泓冰, 汤琳, 周璇, 徐颖, 吴翼伟, 张学光【摘要】目的: 研究抗人CD40单克隆抗体（mAb）5H6的125I 标记及与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性。

方法: 氯氨T法125I标记mAb 5H6(125I5H6), 纸层析法测定125I5H6的标记率和放射化学纯度, 三氯醋酸沉淀法分析125I5H6体外稳定性, 细胞结合饱和实验进行Scatchard分析, lindmo法及其改良方法计算125I5H6的免疫活性分数, 细胞结合实验分析125I5H6同HO8910细胞的内化和滞留。

结果: (1)mAb 5H6的125I标记率为（85.4±5.2）％, 放射化学纯度为(99.2±0.5)%。

(2)125I5H6存放于4℃磷酸缓冲液中7 d后其放射化学纯度为(80.3±4.7)%, 在37℃血浆中存放24 h后其放射化学纯度为(95.3±0.8)%。

(3) 125I5H6与HO8910细胞亲和力Kd=(0.711±0.06) nmol/L, 最大结合位点数(Bmax)=(2.17±0.08）×105个/细胞。

(4)125I5H6免疫活性分数达(38.6±5.4)%。

(5)4℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞滞留率为(89.8±6.0)%, 37℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞内化率达(54.9±2.6)%。

结论: 氯氨T法进行125I5H6标记具有良好的标记率和放射化学纯度, 以及良好的体外稳定性和较高的免疫活性分数, 且125I5H6与HO8910细胞具有很高的亲和力, 可用于动物体内实验。

临床医学检验学主治医师：放射免疫技术必看题库知识点1、单选用于125I标记物纯化的方法错误的是（）.A.凝胶过滤法B.离子交换法C.超速离心法D.高效液相色谱法E.聚丙烯酰胺凝胶电泳正确答案：C解（江南博哥）析：用于125I标记物纯化的方法通常有凝胶过滤法、离子交换法、高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2、单选免疫放射技术的优点有（）.A.灵敏度高B.特异性强C.重复性好D.样品及试剂保存时间长E.操作简便易于标准化正确答案：D参考解析：放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。

此技术灵敏度高（可检测到ng、pg水平）、特异性强、重复性好、样品及试剂用量小是其优点，但核素的放射性对工作人员和环境易造成危害或污染，是其缺点。

3、单选肿瘤标志物的检测中因对人体健康有一定的损害，正逐渐被淘汰的方法是（）A.酶联免疫测定法B.放射免疫测定法C.化学发光免疫测定法D.荧光免疫测定法E.免疫电泳技术正确答案：B4、单选放射免疫分析中标记物的使用为（）.A.核素标记抗原B.核素标记抗体C.限量D.等量E.过量正确答案：C参考解析：放射免疫分析使用核素标记抗原，标记物为限量使用；免疫放射分析使用核素标记抗体；标记物为过量使用。

5、单选放射免疫分析常用的放射性核素错误的是（）.A.125IB.130IC.3HD.14CE.111I正确答案：E参考解析：放射免疫分析常用的放射性核素有：125I、130I、3H、14C等。

6、单选标记免疫技术实际应用时测定的是（）.A.待测抗原与抗体结合后形成的结合物B.待测抗体与抗原结合形成的复合物C.标记物在抗原抗体复合物的信号D.直接测定样品中抗原的含量E.直接测定样品中抗体的含量正确答案：C参考解析：一种定性、定量甚至定位测定技术。

即用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应而检测相应抗原和抗体。

单克隆抗体技术操作流程一、免疫原制备免疫原是制备单克隆抗体的关键，它可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面分子等。

首先需要获得纯度高的免疫原，并进行适当的处理，如去除杂质、进行修饰等。

接下来，将免疫原与适当的佐剂混合，以增强免疫原的免疫原性，如将免疫原与完全佐剂混合，然后注射到小鼠等实验动物体内。

二、免疫动物免疫将制备好的免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生抗体。

通常情况下，需要多次免疫以增强免疫效果。

在每次免疫后，需要采集动物的血清样本，检测抗体的产生情况。

可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法对血清中的抗体进行检测。

三、细胞融合与筛选当动物产生了满意的抗体效价后，需要从其脾脏等淋巴组织中获得抗体产生的细胞。

将脾脏细胞与骨髓瘤细胞（如NS-1细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。

融合后的细胞具有双亲细胞的优点，既能产生抗体，又具有无限增殖的能力。

为了筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，通常需要进行限稀稀释、酶标记法、细胞毒性试验等步骤。

其中，限稀稀释法是最常用的筛选方法，通过将杂交瘤细胞逐级稀释，最终得到单个细胞的克隆。

然后，将这些单克隆细胞扩大培养，并对其产生的抗体进行筛选和鉴定。

四、抗体纯化与鉴定通过培养和扩增单克隆细胞，可以得到大量的单克隆抗体。

接下来，需要对抗体进行纯化和鉴定。

纯化可以使用各种离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术，去除杂质，得到纯度较高的抗体。

鉴定抗体的特异性和亲和力是非常重要的步骤。

特异性可以通过免疫印迹、免疫组化等方法进行检测，判断抗体是否能够特异性地结合目标抗原。

亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）等技术进行测定，评估抗体与抗原的结合强度。

五、应用和保存经过纯化和鉴定后，单克隆抗体可以应用于多个领域，如医学诊断、生物学研究、药物开发等。

在应用过程中，需要根据具体需求对抗体进行合适的标记和修饰，以提高其应用效果。

为了保存单克隆抗体，可以将其冻存于低温下，如-20°C或-80°C。

单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。

他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。

下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。

1)初次免疫,间隔2～3周。

2)第二次免疫,间隔3周。

3)第三次免疫10天后,取血测效价。

4)加强免疫3天后,取脾融合。

2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。

将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。

1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。

2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。

3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。

4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。

单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。

本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。

一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。

其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。

二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。

2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。

3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。

4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。

6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。

三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。

2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。

3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。

4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。

结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。

随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。

相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。

血管内皮细胞检验技术一、血管性血友病因子抗原测定血管性血友病因子抗原（von willebrand factor antigen，vWF：Ag）测定主要用于血管性血友病的诊断与分型。

（一）检验原理免疫火箭电泳法。

在含vWF：Ag的琼脂板中加入定量的受检血浆（抗原）后，在电场作用下，定量的抗原在含抗体的琼脂板上泳动。

在一定的时间内出现抗原抗体反应形成的火箭样沉淀线，沉淀线的高度与抗原的浓度成正比，根据沉淀线的高度计算出血浆vWF：Ag的含量。

（二）检验方法学1.试剂与器材（1）Tris巴比妥缓冲液（pH 8.8）。

（2）琼脂糖凝胶的制备：取琼脂0.9g，加Tris巴比妥缓冲液100ml，加热至沸点，待琼脂完全溶解置50～56℃水浴。

（3）琼脂板的制备：取人血浆vWF：Ag抗血清16.5μl于50ml 烧杯中，置50～56℃水浴。

取50～56℃水浴中的琼脂糖凝胶10ml加入烧杯中（稀释600倍），充分混合后迅速倒入8cm×8cm内径的玻璃槽内。

当凝胶凝固后，除去一块玻片，打孔共10～12个，孔径为2.5mm，间距约为5mm。

（4）标准标本制备：用Tirs巴比妥缓冲液稀释正常混合血浆，比例为原倍∶1∶2、1∶4、1∶8、1∶16，于1、2、3、4、5孔中各加样10μl。

（5）待检标本的制备：将患者全血用0.109mol/L枸橼酸钠作9∶1抗凝，1500r/min离心10分钟，分离血浆，然后用Tris巴比妥缓冲液将标本作1∶2稀释。

按编号，依次加入相应的测定孔中。

2.操作方法（1）每侧电泳槽内加Tris巴比妥缓冲液1000ml。

在加抗原之前，先将打好小孔的琼脂板置于电泳槽内，孔朝阴极，火箭方向为阳极。

用8cm宽的双层滤纸作桥，接通电源，用50V左右的电压。

然后顺序加入标准标本和受检标本。

关闭电泳槽盖，调节电压至110～115V，电流为10～14mA，电泳18小时。

电泳槽温度以小于15℃为宜。

（2）电泳完毕后，取出凝胶板置生理盐水中，然后再浸入1%磷钼酸溶液中（1g磷钼酸加蒸馏水100ml，过滤后使用）20～60分钟，可见火箭样沉淀线，也可用氨基黑染色保存。

体外分析技术一、概论体外标记免疫分析是当今先进的超微量检测技术，它的测量值可精确到毫微克（ng）—微微克（pg），甚至达毫微微克级（fg），它的基础是先进的放射性或非放射性标记技术和先进的抗原—抗体结合的免疫技术。

它主要被用于检测人体的各种激素和各种肿瘤标志物。

是当前的重要检测技术之一。

体外标记免疫分析技术起始于1959年，由美国的Berson和Yalow共同建立了放射免疫分析法（RIA），由于RIA具有灵敏度高、特异性强、重复性好、测量简便、成本低等优点。

在生物学和医学中对机体超微量活性物质的分析取得重要突破而获得飞速的发展，故Yalow在1977年获得诺贝尔奖。

但因RIA法必须使用放射性物质，所以在发展中受到一定限制。

自70年代起科学家们曾先后研究并建立了多种非放射性物质的标记免疫分析，如酶标记免疫分析（EIA）、时间分辨荧光分析（TRFIA)、酶放大发光分析（CLEIA）、化学放光（CLIA）、电化学发光（ECLRA）等，并且可进行仪器的全自动化测定和全自动的数据分析。

各种测定方法主要是标记技术、标记品的不同而采用的测量方法不同，各具特点和优点，其基本原理还是标记免疫技术，其中最基本的还是放射免疫分析和免疫放射分析。

二、放射免疫分析的基本原理放射免疫分析法（Radioimmunoassay,RIA）是建立在放射性分析的高度灵敏性与免疫反应高度特异性基础之上的超微量分析技术。

通过测定放射性标记抗原—抗体复合物的量来计算出待测抗原（样品）的量。

20世纪50年代末Berson和Yalow在研究胰岛素抗体时，首先了建立放射免疫分析法定量测定胰岛素含量，从而开创了生物活性物质微量测定分析的新时代，从此放射免疫分析技术以其灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等优点而独树一帜。

目前应用放射免疫分析技术能测定生物活性物质达300余种，被广泛应用于生物学医学各个领域。

放射免疫分析法的基本原理是竞争性抑制反应。

125I标记单克隆抗体技术同位素标记是一种重要的抗体标记技术，牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。

McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。

(一) 原理氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。

如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。

(二) 方法在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl，再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液再加入10μl(含1mCi)125I↓加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒↓加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于0.05M磷酸缓冲液)↓加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白)↓用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I用4％BSA PBS洗脱↓分部收集，0.5ml／管每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率结合于McAb１２５I放射性强度(cpm)标记率(％)＝───────────────────总放射性强度(cpm)结合于某一管McAb上的放射性强度比活性(μCi／μgMcAb)＝────────────────某一管McAb总量(三) 试剂器材1. 纯化后的McAb2. 0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA3. 125I4. 有通风装置的超净台，γ计数仪5. PD10柱(Sephadex G25)(四) 注意事项1. 严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。

必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。

操作前后对实验室环境进行监测。

所用125I和标记物应妥善保管。

2. 如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。