专题五血红蛋白的提取和分离
【知识框架】
1. 分离不同种类蛋白质可以利用蛋白质各种特性的差异，如分子的__________、所带电荷的_________、_________、__________和对其他分子的_________等。
凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法；电泳是指带电粒子在_______的作用下发生________的过程，许多重要的生物大分子，如＿＿＿＿＿、＿＿＿＿等都具有＿＿＿＿＿＿＿＿，在＿＿＿＿＿＿下，这些基团会带上＿＿＿＿＿＿＿，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷＿＿＿＿＿的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子的差异以及 ___ 、的不同，使带电粒子产生不同的___________，从而实现样品中各种分子的分离。
常用的电泳法有_________________电泳和___________________电泳。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿以及＿＿＿＿＿＿＿等因素。
在测蛋白质分子量（纯度鉴定）时通常使用____ 电泳。
2.当相对分子质量不同的蛋白质通过琼脂凝胶层析时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部，路程较，移动速度；而相对分子质量大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较，移动速度，导致相对分子质量小的流出，相对分子质量大的流出，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
3.蛋白质的提取和分离一般分为四步：、粗分离、和。
（1）样品（哺乳动物的血液）处理和粗分离
样品处理和粗分离的过程为：→→→。
①红细胞的洗涤：目的：去除＿＿＿＿＿；方法：＿＿＿＿＿＿＿＿离心。
采集血样前，盛血容器中需预先加入_______________作为____________，以防止
______。
采血后应及时分离____________和_________，分离方法采用______________（500r/min离心10min），分离后，去除____层透明的黄色血浆，将____层______色红细胞倒入烧杯，加入____倍体积的___________，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次以上，直至____________________，表明红细胞已洗涤干净。
洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法将__________全部除去，如果血液样品离心后分层不明显，可能原因是＿＿＿＿＿；离心速度过____和时间过_____，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到＿＿＿的红细胞，影
响后续提取的血红蛋白的＿＿＿＿。
②血红蛋白的释放：将已洗涤干净的红细胞倒入烧杯，加＿＿＿＿到原血液的体积，使红细胞________，再加40%体积的＿＿＿＿，使________溶解，置于______搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 红细胞破裂释放出血红蛋白。
③分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度进行高速离心10 min ，离心管中的溶液从上往下分为4层:
第1层（最上层）：＿＿＿＿＿＿的______层
第2层（中上层）：＿＿＿＿＿＿＿的沉淀层，＿＿色薄层固体
第3层（中下层）：＿＿＿＿＿的水溶液层，＿＿＿＿的液体
第4层（最下层）：其它杂质的＿＿＿＿＿沉淀层
将试管中的液体用＿＿＿＿过滤、除去＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，于＿＿＿＿＿中静置片刻后，分离出下层的＿＿＿＿＿＿＿＿。
④粗分离：即＿＿＿＿。
将装有血红蛋白溶液的透析袋放入pH为7.0的____________中，透析12h，透析的原理是___ ___________________________ ，透析的目的是____________ ___。
（2）血红蛋白的纯化——凝胶色谱法(层析)
①制作色谱柱：柱体是长40cm、内径 1.6cm的玻璃管，柱顶部插入安装了________的橡皮塞，柱底部插入安装了_______（带头部）的橡皮塞（橡皮塞上部切成锅底状凹穴），在橡皮塞中安装移液管时，移液管上部_______（必需/不能）超过橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆盖尼龙网，再用尼龙纱将橡皮塞上部包好插入柱体的下端，移液管头部作为出口部位，连接细尼龙管，用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭。
②装填凝胶色谱柱：商品凝胶使用前直接放在＿＿＿＿＿中膨胀，并用＿＿＿＿＿将加入洗脱液的_________加热至接近沸腾，这种方法既加速凝胶膨胀，又除去凝胶中可能带有的________和排除凝胶颗粒内的_______。
因为干的凝胶和用缓冲液（洗脱液）平衡好的凝胶的体积差别_______（不大/很大），所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算＿＿＿＿＿＿＿。
交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75）的“G”表示凝胶的_________、
_________及__________，“75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水_____g。
凝胶装填色谱柱时，色谱柱下端连接的尼龙管应_______（打开/关闭），将配制好的凝胶悬浮液_________（一次性/分多次）缓慢倒入色谱柱内，期间_____（可
以/不能）轻微抖动色谱柱，使凝胶装填均匀，凝胶色谱柱内不得有＿＿＿＿存在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的＿＿＿＿＿＿，降低＿＿＿＿＿。
一旦发现凝胶柱内有气泡，必需_______。
凝胶装填完毕，立即连接盛有_______________（pH为7.0）的洗脱瓶，在50cm高的操作压下充分洗涤平衡，使凝胶装填紧密。
③样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，让色谱柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降，当缓冲液缓慢下降到__________________时关闭出口，然后按照下图①～④顺序加样，最后连接装有缓冲液的洗脱瓶进行洗脱，待红色蛋白液接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每试管____mL。
如果凝胶色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带______、________、________地随着洗脱液缓慢流出，反之，如果凝胶色谱柱的装填不好，红色区带_________、________、________，分离效果不好。
通过凝胶色谱(层析)除去透析后的血红蛋白溶液中的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）纯度鉴定：判断＿＿＿＿的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。
在鉴定的方法中，使用最多的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
十二烷基硫酸钠（SDS）能与各种蛋白质形成“蛋白质—SDS复合体”， SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子的电荷量，掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，电泳时，蛋白质的迁移速率完全取决于________________，蛋白质由点样孔向______极迁移，
点样孔在______极一端；SDS能使蛋白质发生完全变性，多肽链蛋白质解聚成单条肽链，因此，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是___________的分子量。
将纯化的血红蛋白样品与若干已知分子量的标准蛋白分别
加入到电泳装置上槽的点样孔中，电泳后，观察血红蛋白条
带与标注蛋白条带的位置，可确定提取的蛋白质的分子量。
图甲的上、下槽中加入_____
______，上、下槽之间是___________________。
比较图乙①～④条带蛋白质的分子量大小：___
________________。
4．血红蛋白的提取和分离常见试剂及其作用：
柠檬酸钠：；生理盐水：；蒸馏水：使红细胞____
_______；40%的甲苯溶液：；磷酸缓冲溶液：维持pH稳定，使血红蛋白的_______________不受破坏。
5．缓冲溶液能够在一定的范围内，能抵制外来_________对溶液_____的影响，维持＿＿＿基本不变，缓冲溶液通常由＿＿＿种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的＿＿＿＿就可以制得＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿使用的缓冲液。
【核心要点】
1.凝胶色谱层析法
蛋白质
相对分子质量大相对分子质量小
项目
凝胶内部不能进入能进入
运动方式垂直向下垂直向下和无规则扩散运动
经过路程较短较长
洗脱次序先流出后流出
2.电泳法原理
①在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。
在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
②由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3．比较琼脂糖凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
4．实验操作程序。
