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免疫组化步骤

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免疫组化步骤

1、 烤片：放于60℃烘箱内，20—25min;

2、 脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；

注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；

3、 复水：100%酒精-——100％酒精——-95%酒精--—90%酒精—-—80％酒精--—70％酒精-——50%酒精，5min/次；

4、 ddH2O洗2次,5min/次；

5、 抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS—0100），125℃，5min；

注:1x修复液:198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x，混匀；

抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close"对准白点,“open”所指处与边缘无缝隙,设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；

6、 修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次,5min/次；

7、 去除 H202酶：3％H202,15min；注意遮光；

注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml

PBS 50ml 3%H202)

8、 PBS 2次，PBST 1次，5min/次;

9、 封闭(blocking)：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温

1h，湿盒;封闭液不要过多,以免溢出；

注：封闭液：1xPBS，0.3％Triton X-100，10% goat

serum(如:870ulPBS+30ul 10% Triton X—100+100ul 10% goat

serum 1ml封闭液）;

10、 孵一抗:用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h)，湿盒。对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；

常用抗体的稀释比例：GFAP-—1：200，Ki67-—1：200，CD31-—1：20～1：40,Flag——1:200,Nestin——1：200,III-Tubulin——1：1000

11、 室温,30min；(从冰箱拿出时动作也要缓慢）

12、 PBST洗3次，5min/次；

注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10％Triton X-1000 ；

13、 ①加荧光标记的二抗(封闭液稀释抗体1:1000），1h,室温，湿盒;②加HRP标记的二抗(封闭液稀释抗体1：10000），室温30min；

注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；

14、 PBST洗3次，5min/次；

15、 若①复染:DAPI染色,避光，5min;若②TSA放大3～10min，PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；

注:DAPI:50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍

16、 封片:直接向组织滴加抗荧光淬灭剂,注意不要产生气泡，盖盖玻

片时也要注意不要产生气泡，避光4～5min后即可拍片。

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免疫组化原理步骤及要注意的事项

免疫组化原理步骤及要注意的事项

免疫组化原理步骤及要注意的事项

免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义。下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意的事项。

原理：

免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。

-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位于细胞或组织的特定位置。

-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，发出可见信号，用于检测和记录。

步骤：

免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、一抗染色、二抗染色和显微镜观察。

1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂片和细胞悬液。样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。

2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。 3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来阻断非特异性背景信号。常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛血清白蛋白或BSA预处理等。

4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，构成抗原-抗体复合物。为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。

5.二抗染色：一抗与抗原结合后，用特异性二级抗体进行检测，二级抗体上带有标记物（如荧光素、酶等），对抗原-抗体复合物进行定位。

6.显微镜观察：通过显微镜观察，检测特定信号的强度和位置，同时进行结果的记录和分析。

注意事项：

-选择合适的抗体：免疫组化的关键在于合适的抗体选择，需要选择高度特异性和高亲和力的抗体。

免疫组化技术

免疫组化技术

（一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；

2）水浴锅

（二）、试剂

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，

KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS(或PBS)配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

2）无水乙醇中浸泡5分钟；

3）95%乙醇中浸泡5分钟；

4）70%乙醇中浸泡5分钟；

2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复

（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

免疫组化(SP法)原理步骤及试剂

免疫组化(SP法)原理步骤及试剂

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原理

抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）

1、免疫荧光方法

最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。

免疫组化相关步骤

免疫组化相关步骤

免疫组化操作步骤

（一）、仪器设备

1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.

2. 水浴锅

（二）、试 剂

1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.

4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制

7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制

8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟

b 无水乙醇中浸泡五分钟

c 95%乙醇中浸泡五分钟

d 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

A 抗原热修复

a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。