抗体原液冻融过程中稳定性探究及冻融工艺建立

药物的免疫原性分析方法浅析摘要：药物的免疫原性评价是临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的抗体反应会影响药动学、药效或毒性反应。

ADA的产生会缩短或延长药物半衰期，改变药物在体内的生物分布。

免疫原性的分析在复杂的血清基质中进行，涉及到多学科多领域。

分析方法及检测水平也存在不一致的情况，需要规范实验操作，提高检测的有效性。

免疫原性评价是药物开发阶段中安全与疗效评价的需要，也是申报提交的关键要素。

开发有效的免疫原性检测方法意义重大。

关键词：免疫原性，MRD，方法学验证正文免疫原性通常是指治疗性蛋白和/或代谢物诱发其自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。

一般分子量越大免疫反应越强。

分子量低于4000时一般不具有免疫原性，在4000到10000之间时具有弱免疫原性，分子量大于10000时具有强免疫原性。

但是也有例外要根据物质的结构决定。

免疫原性分析必须在临床前和临床阶段均开展。

具有免疫原性的物质可能诱发机体产生有害的免疫反应，甚至威胁生命。

免疫原性评价需要有效特异的检测方法。

在临床前便需要确定检测方式，在方法的设计、开发和验证中需要严格控制各环节。

临床前和临床中样本的检测需使用经过严格验证的方法进行检验。

目前应用较广泛的是平台主要包括ELISA、ECL、RIA和SPR。

检测方法一般为夹心法、间接法或直接法。

免疫原性方法学的开发要考虑多种因素，主要包括反应模式的选择、包被抗原浓度的选择、包被条件的选择、封闭条件的选择、样品稀释液的选择、最小稀释度（MRD）的选择、酶稀释液的选择、显色液时间的选择以及各条件的孵育时间及温度的选择。

每个反应步骤都会影响方法的性能。

阳性抗体的质量直接影响方法的灵敏度。

阳性抗体需要稀释在与待检样本一致的空白动物血清中。

由于基质的复杂性，在很大程度上会增加检测背景，需要优化各反应条件将背景降低。

对于背景的高低无确定的要求，但是背景越低越好，太高的背景也会影响检测灵敏度。

开发过程中要优先考虑灵敏度和耐药性，其次为精密度、选择性、特异性、稳定性。

正文内容稳定性考察中的热循环（冻融）实验简介
黄晓龙
新药研究单位在设计药品的稳定性考察实验方案时，往往注意通过一系列的影响因素实验来选定药品的包装与储存条件，通过标准条件下的长期留样实验来确定产品的有效期。

但经常会忽略一些特殊的药品在运输或使用过程中因为温度的变化而可能给产品的质量所造成的不利影响。

美国FDA1998年6月发表的稳定性指导原则草案对此问题提出了一个解决的办法，即对于易发生物相分离、黏度减小、沉淀或聚集的药品需通过热循环实验来验证其运输或使用过程中的稳定性。

作为影响因素实验的一部分，应模拟药品在运输与使用过程中可能碰到的温度条件下循环考察上市包装的药品的稳定性。

具体方法如下：
1）对于温度变化范围在冰点以上的药品，热循环实验应包括三次循环，每次循环应在2~8℃两天，然后在40℃加速条件下考察两天。

2）对于可能暴露于冰点以下的药品，热循环实验应包括三次循环，每次循环应在-10~-20℃两天，然后在40℃加速条件下考察两天。

3）对于吸入气雾剂，推荐的热循环实验包括一天内进行三到四次六小时的循环，温度在冰点以下和40℃（75~85%RH）之间，该实验需持续考察六周。

4）对于冷冻保存的药品，应考察该药在微波炉或热水浴中加速融化时的稳定性，除非说明书中明确禁止如此操作。

如经过验证，也可采用其他的方法进行考察。

参考文献
Guidance for Industry: Stability Testing of Drug Substances and Drug Products (Draft Guidance), June 1998.
类别:审评三部。

RhD全分子IgG的稳定性研究及优化效果分析随着生物技术的发展，重组抗体在临床医学中的应用越来越广泛。

RhD全分子IgG是一种针对RhD抗原的全长免疫球蛋白G抗体，用于预防RhD阴性孕妇接触RhD阳性胎儿导致的溶血反应。

本文将从RhD全分子IgG的稳定性研究和优化效果两个方面来探讨相关内容。

首先，对RhD全分子IgG的稳定性进行研究具有重要意义。

稳定性是指抗体在存储、运输和使用过程中的物理化学和生物学特性的保持程度。

稳定性研究的目的是确保抗体的质量不受影响，保证其在临床应用中的有效性和安全性。

要确定RhD全分子IgG的稳定性，首先需要考虑的是温度对其稳定性的影响。

研究表明，在4℃下存储可以显著延长RhD全分子IgG的保持时间。

此外，对于冻干剂型的制备，低温冷冻存储也是一种常见的选择，可以保持抗体的活性和稳定性。

除了温度，光照也是影响RhD全分子IgG稳定性的一个因素。

光照会引发抗体的氧化和降解，因此需要采取适当的措施来避免光照。

例如，可以选择使用不透光的容器储存抗体，避免暴露在阳光直射下。

此外，在生产和贮存过程中，可以添加适量的防光剂来保护抗体的稳定性。

另外，pH也是影响抗体稳定性的重要因素。

研究表明，RhD全分子IgG在酸性环境中易于降解，因此需要确保合适的pH值以维持抗体的稳定性。

通常，将抗体溶液的pH值保持在稳定范围内（通常为6.5-7.5），可以较好地保护其稳定性。

在研究了RhD全分子IgG的稳定性后，我们还需要分析在优化条件下的效果。

优化条件旨在优化抗体的稳定性和存储寿命，以确保其在临床应用中的高效性。

以下是一些常见的优化策略：首先，可以通过改变抗体的制备工艺来优化其稳定性。

例如，在克隆抗体的制备过程中，可以优化培养基的成分和条件，以获得高产量和高质量的抗体。

其次，可以通过添加稳定剂来增强抗体的稳定性。

稳定剂可以保护抗体免受温度、光照和pH等因素的影响。

常用的稳定剂包括蔗糖、甘油、聚乙二醇等。

生物制品如何开展稳定性试验我们在购买食品时，都会仔细看“生产日期、存储条件、有效期”等信息，明白假如在食物存储不当或者超过有效期的状况下，我们就不能食用，以免食物中毒或腹泻。

药品更是如此，为了保证药品的有效性和平安性，我们应如何掌握其运输、存储的条件，如何制定其有效期范围？要得到这些答案就需要通过严谨的试验加以验证，这就是我们接下来要说的内容——稳定性试验。

稳定性试验贯穿于产品的全生命周期之中。

在工艺开发阶段，小试产品的稳定性探究可以为后续中试产品的稳定性讨论做预判；在新药注册申报时，需要完成稳定性试验（长期稳定性试验、临床使用稳定性试验、反复冻融稳定性、运输稳定性等），以指导在临床试验阶段试验用药的存储及使用；药品上市后，虽然产品没有发生变化，但每年也必需要做持续稳定性考察。

每个产品都有其独特的工艺，针对不同的产品最好要有与之对应的单个方案。

方案一般包含以下几个方面：样品、考察条件、试验周期、检测项目、检测方法、接受标准等。

方案在起草后，应经过审核、批准后执行。

生物制品稳定性试验一般包括长期稳定性试验、加速稳定性试验、强制试验（也称影响因素试验，属于稳定性试验的探究）。

长期稳定性试验一般是在推举的贮藏条件下进行的，其可以作为制定产品储存条件和有效期的重要依据。

加速稳定性试验一般是在长期与强制试验条件之间进行的，其目的在于评估运输和存储过程中条件的短期偏离对产品的影响（包括生物降解或物理变化等）。

强制试验一般是在更恶劣、更极端的环境下进行，其目的在于评估产品的降解途径、破坏程度，也被用来评价产品杂质（降解产物）分析方法的有效性。

以下分内容进行说明稳定性试验详细包括哪些，应当怎么做。

1、样品在《生物制品稳定性讨论技术指导原则》中，对其就有具体的说明“讨论样品通常包括原液、成品、中间产物及产品自带的稀释液或是重悬液。

凡涉及到不连续操作的生产工艺步骤，其中间产物需要严格的贮存操作的均需要进行相应的稳定性讨论，以证明该贮存操作不会影响到后续工艺产品的质量。

室温稳定冻干单克隆抗体制剂的赋形剂你知道吗？现在的药物研发已经越来越厉害了，尤其是在抗体制剂这一块。

单克隆抗体，这个名字一听就有点高大上，对吧？其实它就是一种特别聪明的“蛋白质小兵”，专门用来对付一些不太友好的病菌或病毒。

不过，要把它们从实验室拿到我们的生活中，变成能够稳定保存、长期有效的药品，过程可不是轻松的。

尤其是冻干这一技术，不仅复杂，而且背后还藏着一堆小秘密。

而冻干过程中，赋形剂，这个小伙伴，就成了让一切顺利进行的“幕后英雄”。

先说说什么是冻干。

简单来说，冻干就是把液体药物“冻”成固体，然后去掉其中的水分，保存成一种稳定的粉末，等需要用的时候再加水溶解。

这样不仅能延长药物的保质期，还能方便运输。

你想想，如果直接运输液体药物，温度一不对，或者搬运的时候不小心磕着了，药物就可能失效了。

冻干制剂就能解决这个问题。

可是，冻干后的单克隆抗体要想保持活性，可不简单。

就像冰箱里的冰激凌，冻得再好，融化后的味道不一定一样。

所以，这时候就需要一些“赋形剂”来帮忙了。

赋形剂，这个词说起来很专业，其实就是那些“配角”，它们不会直接和病菌打交道，但却帮助抗体们稳定、保护它们，让它们在存储和使用过程中不被“摧残”。

你可以把赋形剂想象成保镖，虽然不在前线，但却是抗体们不可或缺的朋友。

有了它们的保护，抗体们才能安稳地在冻干后的状态下呆上好一段时间，等着救场。

这些赋形剂到底有哪些呢？其中最常见的要数糖类、氨基酸和一些缓冲液。

糖类，比如蔗糖和甘露醇，它们能够吸引周围的水分子，把抗体“包围”住，防止冻干过程中蛋白质结构的变化。

你可以想象一下，糖就像是一把把伞，给抗体们撑起一个“保护伞”，避免它们在干燥、冰冻的过程中受伤。

而氨基酸，它们则像是修理工，帮助抗体维持结构的稳定性，让抗体在冻干、再溶解的过程中不会“崩溃”得一塌糊涂。

至于缓冲液，它们的作用就像是让抗体们保持一个稳定的环境，不让酸碱度的变化搞得它们“晕头转向”。

你会好奇，既然这些赋形剂这么重要，那是不是加得越多越好？答案可不是这样哦。

抗冻剂提高肉糜类制品冻融稳定性的研究进展及展望
崔悦;刘锞琳;许龙;祝超智;马长明;余小领
【期刊名称】《河南科技学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2024(52)2
【摘要】冻藏过程中温度变化导致的冻融循环会使肉糜类制品出现汁液流失、蛋
白质变性、营养价值损失等问题,严重影响产品的风味、口感等食用特性.抗冻剂是
一类能够有效提高抗冻能力,保证产品品质稳定的食品添加剂.文章综述了磷酸盐类、糖和糖醇类、抗冻蛋白三种抗冻剂的抗冻机理以及在肉糜类制品中的应用,并对一
种同样具有抗冻作用的蛋白类物质——蛋白基Pickering乳液进行了展望,希望为
改善肉糜类凝胶制品冻融稳定性而开发出符合人们健康需求且成本低廉、适合工业化生产的新型抗冻剂提供思路.
【总页数】8页(P33-40)
【作者】崔悦;刘锞琳;许龙;祝超智;马长明;余小领
【作者单位】河南农业大学食品科学技术学院;河南麦瑞克食品科技有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS251.4
【相关文献】
1.蒸压粉煤灰砖冻融后抗压强度提高的原因探讨——兼议国标《砌墙砖试验方法》对非烧结砖抗冻性能试验方法的规定
2.浅析混凝土冻融破坏机理及提高混凝土抗
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稳定性实验方案（参考）诊断原料稳定性考核主要包括热稳定性、真实稳定性、运输稳定性及冻融稳定性四部分，工作流程如下图所示，具体方案见下文。

根据抗原和抗体进行分类，此外结合产品的用途，综合考虑上述实验内容的安排和设计，以便满足市场客户需求，合理调配公司资源。

现给出各类型开展稳定性评价分具体实验方案。

1蛋白的稳定性实验方案1.1发货蛋白的稳定性实验各项目负责人根据项目特点，确定发货的蛋白稳定性实验内容。

因为发货浓度一般都是以mg/ml作为单位，所以考核其稳定性主要是用于存放条件的确定。

考核方案以持续检测和对比实验为主，一般不开展高温热加速实验，因为高温热加速实验本身就很难保证稳定性合格，此外为了使其稳定，添加的稳定剂或类似物质后影响抗原的后期使用。

发货蛋白初始存放条件为-20℃，可以开展2-8℃稳定性对比实验。

以分别在-20℃和2-8℃条件下存放一定时间（根据项目而异），采用免疫学或适宜方法开展平行比较，以平行分析之间的差异评价蛋白是否可以存放于2-8℃条件下。

只有在2-8℃条件下评价稳定，再根据项目情况来综合考虑是否要做37℃下的热稳定性实验。

根据上述实验进一步确定发货蛋白的存放条件，以此确保在特定保存条件下的稳定性。

持续检测的实验主要目的是为了在较长时间内监测蛋白真实稳定性而开展的评价内容。

主要采用相对稳定的检测方法，对存放在特定条件下的蛋白开展的结果重现性实验。

例如：采用经过热稳定性评价合格的抗体制备的检测系统，该检测系统批间差异在理想范围内，采用该系统对考核蛋白进行持续检测，持续检测的结果在一定范围内（可以参考绘制质控图，如L-J质控图），判定为稳定性是否合格。

1.2工作条件下蛋白的稳定性实验各项目负责人根据项目特点，确定工作条件下的蛋白稳定性实验内容。

工作条件下的稳定性考核主要涉及校准品、质控品等的稳定性问题，是基于客户使用的立场开展的用途评价及相关研究。

工作重点主要是稳定性基质的筛选和评价、稳定性的持续监测等。

原液冻融验证方案1. 引言冻融验证是一种常见的实验方法，特别适用于液体样品。

其中，原液冻融验证是针对难以固态化的液态物质进行的验证实验。

本文档旨在提供一份原液冻融验证方案，包括实验材料、操作步骤和数据分析。

2. 实验材料•原液样品：选择待验证的液态物质，确保其纯度和特性符合实验要求。

•试剂：根据实验需要选取适当的试剂，例如冻融缓冲液、酶解剂等。

•实验器材：显微镜、离心机、加热装置等。

•实验耗材：培养皿、离心管、移液管等。

3. 实验步骤3.1 样品准备1.将原液样品倒入干净的培养皿中，确保样品量足够进行实验。

2.按照实验要求，添加适量的冻融缓冲液或其他试剂，用以稀释或调整样品浓度。

3.搅拌样品溶液，确保混合均匀。

3.2 冻结处理1.将样品溶液倒入带有盖子的离心管中。

2.将离心管放置在-20°C冷冻库中，冻结时间根据样品特性和实验设计确定。

3.冻结结束后，将离心管转移到常温下，等待样品融化。

3.3 反复冻融处理1.将融化的样品离心，以去除可能存在的固体沉淀。

离心条件根据样品特性和实验设计确定。

2.将离心后的样品再次冷冻，并进行一定的冻结时间。

3.冻结结束后，再次将离心管转移到常温下，等待样品融化。

3.4 实验观察与记录1.在每次融化后和冻结后，使用显微镜观察样品的形态变化，记录下每个观察时间点和对应的样品状态。

2.如果需要，可以在融化后进行酶解或其他处理，然后观察相应的反应或变化。

4. 数据分析根据实验中观察到的样品形态变化和实验设计，可以进行以下数据分析：1.形态变化的描述：对于每个观察时间点，记录下样品的形态变化情况，例如颜色、透明度、颗粒分布等。

2.形态变化的趋势：根据记录的数据，分析样品在冻结和融化过程中的整体趋势，例如颗粒的聚集或分散、颜色的变浅或加深等。

3.形态变化的机理分析：根据已有的文献或理论知识，对样品的形态变化进行机理分析，解释观察到的变化现象。

5. 结论通过原液冻融验证实验，我们得出以下结论：1.针对特定原液样品，在反复冻融处理下，观察到了不同的形态变化。

冷冻干燥制剂的稳定性研究进展武华丽,胡一桥(中国药科大学药剂教研室,江苏南京210009)摘要:目的介绍冷冻干燥制剂在生产和贮运过程中影响药物稳定性的因素及冻干保护机制的研究进展。

方法综述冻干制剂在生产(分装、冷冻、干燥)和储存过程中影响药物稳定的因素;介绍了冻干保护剂的几种保护机制。

结果与结论研究冻干制剂稳定性对于生物技术药物制剂的开发有重要意义。

关键词:冷冻干燥;稳定性;蛋白质;玻璃化中图分类号:R94文献标识码:A文章编号:1001-2494(2001)07-0436-03随着生物技术的高速发展,多肽蛋白质类药物不断涌现,可应用于临床的多肽、蛋白酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等成为开发重点,目前已有35种重要治疗药物上市。

生物技术药物的基本剂型是冻干剂。

冷冻干燥技术早期主要用于生物材料的保存,其原理是利用冷冻的溶液在低温低压条件下,从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥。

冷冻干燥技术可以使药物保持原有的理化性质和生理活性,且有效成分损失极少。

此外,冻干制剂特有的疏松多孔结构,可以使药物易于重新复水而恢复活性,而且冻干制剂含水量低,易长期稳定保存。

冻干制剂的低共熔态多孔结构在口腔内可迅速溶化释出药物,因此该技术现在也用于口服速溶制剂[1]。

尽管与液体制剂相比冻干制剂稳定,但是冷冻干燥是一个非常复杂的过程,在预冷第一、第二干燥阶段和储存过程中,药物的结构可能受其中的物理化学变化影响而发生变化,特别是蛋白质多肽类药物的二、三级结构易受破坏,失去活性而影响药效。

本文对近年来国内外学者对冻干过程中药物稳定性问题的研究进展进行了综述。

1水分含量严格控制水分含量是保证冻干制剂质量的关键。

水分含量对冻干制剂质量的一个重要指标)))玻璃转化温度(Tg)有影响,即药品的水分含量越低,其Tg越高,药品越能长期稳定地储存。

通常冻干制剂的水分含量要求控制在1% ~3%之间,以保持稳定。

在水分含量较低时,药物的溶剂降解反应呈零级动力学模式[2]。