猪胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素研究进展

猪蓝耳病（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引山西猪场猪蓝耳病并发猪胸膜肺炎放线杆菌的病毒鉴定及细菌分离鉴定以及治疗方案张小敏，郭 波，段宝敏，冯敬敬，李 嘉，雷向东，陈家锃*（天津渤海农牧产业联合研究院有限公司,天津 300000; 天津瑞普生物技术股份有限公司, 天津 300000)起的一种高度接触性传染性疾病，是一种免疫抑制病，常继发或并发感染猪链球菌、鼻支原体、胸膜肺炎放线杆菌病[1]。

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuro pneumia ， APP)是由胸膜肺炎放线杆菌引起以出血性纤维素性胸膜摘 要：2020年2月份山西某大型规模猪场育肥猪突发呼吸困难，无过多症状表现，即突然死亡，发病率为2%，死亡率1.5%左右。

实验室以病死猪为研究对象，综合死亡猪只脏器病变状况观察，无菌采集病死猪的肺脏、肝脏、脾脏病料，进行RT-PCR 检测猪蓝耳病原；用含1%NAD 和5%胎牛血清的TSA 琼脂培养基进行细菌分离培养和纯化，经形态学鉴定、PCR 鉴定、16SrRNA 基因序列进化树构建等方法，结果显示：该发病猪群为猪繁殖与呼吸障碍综合征并发猪胸膜肺炎放线杆菌感染。

药敏试验结果显示：该猪胸膜肺炎放线杆菌对安普霉素、硫酸黏菌素、替米考星+氟苯尼考、替米考星+阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋钠+硫酸黏菌素、头孢喹肟、头孢噻呋钠+新霉素、替米考星+头孢噻呋钠、多西环素+氟苯尼考、头孢噻呋钠+阿莫西林、阿莫西林+克拉维酸钾、头孢噻呋钠+恩诺沙星、新霉素、头孢噻呋钠、安普霉素+头孢噻呋钠敏感。

对恩诺沙星耐药。

本实验室根据临床及检测结果制定治疗方案，为该猪场的猪繁殖与呼吸障碍综合征并发猪胸膜肺炎的临床诊断及用药提供了理论依据。

关键词：猪；猪繁殖与呼吸障碍综合征；胸膜肺炎放线杆菌；分离鉴定；药敏试验Virus identification and bacterial identifcation and isolation and Treatment of PRRS with APP in a pig farm of Shanxi provinceXiaomin Zhang; Bo Guo; Baomin Duan; Jingjing Feng; Jia Lee; Xiangdong Lei; Jiazeng Chen *(Tianjin Bohai Sea United Research Institute of Agriculture and Animal Husbandry Co. , Ltd. , Tianjin 300000, China; Tianjin Ruipu Biotechnology Co. , Ltd. , Tianjin 300000, China)Abstract: Fattening pigs in a large-scale farm in Shanxi developed sudden respiratory disease, without excessive symptoms and died suddenly in February . The incidence rate was 2% and the mortality rate was about 1.5%. In our laboratory, the diseased pigs were selected as the research objects, and the pathological changes of the organs were observed. Lung, liver and spleen samples were collected from the dead pigs. The bacteria were isolated, cultured and purified on TSA Agar medium containing 1% NAD and 5% fetal bovine serum (FBS). The results were obtained by morphological identification, PCR identification and construction of phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence, it was PRRS complicated with APP infection. The results of the drug sensitivity test showed that, this actinobacillus pleuropneumoniae is sensitive to Apramycin, colistin sulfate, tilmicosin + Florfenicol, Amoxicillin, Florfenicol, cefotifuroxime sodium + colistin sulfate, cefquinome, cefotaxime sodium + Neomycin, tilmicosin + cefuroxime sodium, doxycycline + Florfenicol, ceftiofur sodium + Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanate, cefuroxime sodium + Enrofloxacin, neomycin, cefuroxime sodium, Apramycin + Cefuroxime sodium. It is resistant to Enrofloxacin. According to the clinical and test results, the treatment plan was made in our laboratory, which provided the theoretical basis for the clinical diagnosis and medication of PRRS complicated with porcine APP .Key words: Pig; PRRS; APP; Dsolation and identification; Drug sensitivity test作者简介：张小敏（1989-）,女,本科,研究方向为疫病诊断与流行病学调查,183****************通信作者：陈家锃(1985-),男,高级兽医师,博士,主要从事动物疫病监测及流行病学调查,**************肺炎为病理特征的一种高度接触传染性呼吸道传染病，能引起猪急性纤维素性胸膜肺炎或慢性局灶性坏死性肺炎。

华中农业大学硕士学位论文猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究Research on identification and function of type Ⅱtoxin-antitoxin system in Actinobacillus pleuropneumoniae 研究生 : 赵席功学号 : 2015302110163指导教师 : 贝为成教授指导小组：周锐教授申邦教授栗绍文副教授王喜亮副教授郑金水副教授专业：预防兽医学研究方向：动物传染病获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月华中农业大学动物科技与动物医学院二○一八年六月猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究目录摘要 (i)Abstract (ii)缩略词表（Abbreviation） (iv)第1章文献综述 (1)1.1 胸膜肺炎放线杆菌 (1)1.1.1 病原学 (1)1.1.2 流行病学 (2)1.1.3 致病机理 (3)1.1.4 诊断及防治 (5)1.2 毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system, TAS） (6)1.2.1 毒素-抗毒素系统的研究进展 (6)1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌中的II型TA系统 (7)第2章研究目的与意义 (9)第3章材料和方法 (10)3.1 实验材料 (10)3.1.1 菌株、质粒和培养条件 (10)3.1.2 实验所用酶、试剂和仪器 (15)3.1.3 主要培养基及抗生素配制 (15)3.1.4 主要溶液的配制 (16)3.1.5 引物 (17)3.1.6 实验动物 (19)3.2 实验方法 (20)3.2.1 生物信息学预测分析 (20)3.2.2 TA系统的共转录分析 (20)3.2.3 验证毒素的作用 (21)3.2.4 毒素的杀菌作用 (24)3.2.5 验证抗毒素的作用 (25)3.2.6 毒素抗毒素的相互作用 (25)3.2.7 大肠杆菌WM3064和β2155感受态细胞的制备 (26)3.2.8 抗毒素对TA操纵子的自动调节 (27)3.2.9 TA系统在APP各血清型中的分布 (29)3.2.10 突变株的构建与鉴定 (29)3.2.11 胸膜肺炎放线杆菌电转化感受态制备及电转化 (30)3.2.12 互补菌株的构建与鉴定 (31)3.2.13 突变株与互补菌株生物学特性 (31)第4章结果与分析 (33)4.1 猪胸膜肺炎放线杆菌TA系统的预测 (33)4.2 TA系统共转录分析 (33)4.3毒素在大肠杆菌生长中的毒性作用 (34)4.4抗毒素作用的评估 (36)4.5毒素抗毒素的相互作用 (37)4.6抗毒素对TA操纵子的自动调节作用 (38)华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文4.7 TA系统在APP各血清型中的分布 (39)4.8突变株的构建与鉴定 (41)4.9突变株的遗传稳定性 (41)4.10互补菌株的构建与鉴定 (42)4.11互补菌株的遗传稳定性 (43)4.12突变株与互补菌株的生长特性 (43)4.13突变株对小鼠的存活实验 (44)第5章讨论 (45)第6章结论 (47)参考文献 (48)附录 (57)致谢 (58)猪胸膜肺炎放线杆菌II型毒素-抗毒素系统的鉴定与功能研究摘要胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一种能够引起临床上以急性出血和坏死性、慢性纤维素性胸膜肺炎为主要特征的高度接触传染性疾病猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumoniae，PCP）的病原菌，一旦发病，将给国内外养猪业带来很大的经济损失。

猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia ， PCP ）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae ，APP ）感染引起的一种传播迅速、传染性强的猪呼吸道传染病。

最急性型和急性型时，病猪无先兆症状，突然死亡。

耐过猪只可能转归为亚临床感染，不表现临床症状，但持续排出病菌，导致感染猪群中很难控制和根除该病（Bosse 等，2002）。

1 病原学胸膜肺炎放线杆菌（APP ）是一种典型球杆状菌体、有荚膜的革兰氏阴性菌。

根据体外生长时是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ），APP 可分成生物Ⅰ型（NAD 依赖型）和生物Ⅱ型（NAD 不依赖型）两种。

根据细菌细胞壁外荚膜中荚膜多糖（CPS ）的成分不同，APP 分为19个血清型，但仍有一些菌株无法分型（Stringer 等，2021）。

2 流行病学在大多数案例中，猪传染性胸膜肺炎是由亚临床感染的猪只排菌引起（Klinkenberg 等，2014）。

本病一年四季皆可发生，但在冬春（寒猪传染性胸膜肺炎防控及净化策略探讨赵月桥 1，胡耀方 1，于学祥 1，陆时娟 2，王久红 3，李文涛 1，何启盖 1 *（1.华中农业大学动物科技学院动物医学院，湖北 武汉 430070；2.广西扬翔股份有限公司，广西 贵港 537000；3.湖北金林原种畜牧有限公司，湖北 武汉 430200）基金项目：财政部和农业农村部：国家现代农业（生猪）产业技术体系（CARS-35）共同作者：赵月桥，女，硕士研究生；胡耀方，女，博士研究生*通信作者：何启盖，男，华中农业大学教授，E-mail ：*************** 冷）季节发病率高；各阶段猪只均对APP 易感，但90日龄左右猪只最为易感。

APP 在猪群内主要是通过口腔或是鼻腔分泌物接触传播，或通过0.5～3 μm 大小的气溶胶液滴在2 m 内短距离传播。

动物医学进展,2003,24(1):92293P rogress in V eterinary M edicine猪放线杆菌溶血性毒素的研究许信刚,张耀相,张　琪,张强哲,邢福珊,李健强(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵712100)中图分类号:S 852.9.619 文献标识码:A 文章编号:100725038(2003)0120092202摘　要:在37℃条件下,将猪放线杆菌在胰胨酵母浸出物培养基(含10mm o l L CaC l 2)上培养不同时间,离心、过滤后获得不同时间无菌滤液,检验滤液对猪、牛、山羊、绵羊、驴红细胞的溶血性,结果表明这种溶血性毒素对绵羊、牛的红细胞溶血性最强,猪次之,山羊、驴最差。

同时对溶血性毒素理化特性做了初步研究,结果表明:滤液经2.5g L 胰酶处理后溶血活性几乎丧失,不同温度处理后溶血活性下降,经不同pH 值溶液处理后也表现出溶血活性降低和失活现象。

关键词:猪放线杆菌;溶血性毒素猪放线杆菌(A ctinobacillus su is )主要感染六个月内小猪,表现为急性败血症,也可引起人类的菌血症、上呼吸道感染和伤口感染[1]。

据研究报道,放线杆菌属各菌的致病力差别很大,这与其产生的毒素因子有关,包括:荚膜和粘液层,脂多糖,R TX 毒素。

胸膜肺炎放线杆菌(A .P P .)能产生3种R TX 毒素:ap x 、ap x 、ap x [2]。

R TX 毒素是一类致人和动物疾病的革兰氏阴性菌分泌的大分子量不耐热的钙依赖性细胞穿孔素[3],A p x 毒素具有溶细胞活性和细胞毒性作用。

研究表明A p x 具有强的溶血性和细胞毒性[4],A p x 溶血活性弱并具有中等程度的细胞毒性。

A p x 为弱溶血性毒素,而猪放线杆菌培养物上清液具强的溶血性和细胞毒性。

推测猪放线杆菌可能还产生与A p x 相对应的毒素。

E lbarte (1994)用A p x 和A p x 的特异性单克隆抗体对A .su is 培养上清液做免疫印迹分析,发现上清液中存在与A p x 、A p x 迁移率相似的蛋白质成分[5]。

警惕猪呼吸道的杀手，放线杆菌胸膜肺炎放线杆菌胸膜肺炎又称传染性胸膜肺炎，是猪的一种严重呼吸道疾病，给养猪生产造成严重经济损失。

该病病原为胸膜肺炎放线杆菌（APP），是呼吸道疾病综合征的主要病原之一。

目前全国很多地区已经进入胸膜肺炎的高发期。

由于伪狂犬病野毒的感染率极高，全国各地猪场胸膜肺炎的发病率居高不下，尤其是在炎热和雨水比较多的季节（气压低），更容易发生。

1.病原体胸膜肺炎放线杆菌是一种革兰氏阴性菌，有两个生物型。

生物Ⅰ型的生长依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是主要的致病型；生物Ⅱ型的生长无需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，致病性弱。

根据细菌荚膜多糖和脂多糖的抗原性可将APP分成15个血清型，其中1、5、9、11和12型通常具有很强毒力，血清型之间交叉反应不明显。

同一猪群可同时感染几种血清型。

APP的毒力因子很多，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、溶血外毒素、粘附因子和菌毛等，其中溶血外毒素是引起宿主肺部病变的最主要因素。

一种血清型可以分泌一种或两种毒素，但不同血清型也可分泌同一种毒素。

在APP的15个血清型中，目前已发现四种不同的溶血毒素，分别是ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。

前三种是APP致病的主要毒素，具有不同的溶血活性和细胞毒性，也是APP主要的保护性抗原。

2.流行病学和发病机理APP产生的毒素会导致猪肺部严重损伤。

该菌可以感染从断奶到屠宰的各日龄的猪，但通常发生在8至16周龄的猪。

在母猪群当中并不常见，除非母猪从未接触过该病菌（没有免疫力）。

潜伏期非常短，最短可能只有12小时。

3.促进因素3.1一些免疫抑制病如PRRS、PCV2、霉菌毒素中毒等可促进APP的发生；同样一些呼吸道病原体如肺炎支原体、萎缩性鼻炎、猪流感等也会促进APP的发生。

伪狂犬病野毒抗体阳性率高的猪场，胸膜肺炎的发病率高。

3.2环境和管理因素本病的发生受外界因素影响很大，气温剧变、潮湿、通风不良、频繁转群、饲养密集、管理不善等条件下多发，一般无明显季节性。

一、实验背景猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种猪呼吸道疾病，具有高度的传染性和致死性。

该病在全世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

APP的主要致病因子包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白和溶血毒素（Apx）。

其中，溶血毒素Apx在APP的致病过程中起着重要作用。

本研究旨在提取纯化APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，并研究其对小鼠的致病性和免疫原性，为研制有效的疫苗提供理论依据。

二、实验材料1. 实验动物：SPF级昆明小鼠，体重18-22g。

2. 菌株：猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型、血清7型、血清3型。

3. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶、Taq酶、琼脂糖、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA marker、蛋白marker、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western blot试剂、抗体等。

4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台、孵育箱、培养箱、显微镜等。

三、实验方法1. APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取与纯化（1）分别将APP血清10型、血清7型、血清3型接种于LB液体培养基，37℃培养过夜。

（2）收集菌液，12,000r/min离心10min，弃上清，收集菌体。

（3）将菌体用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶，37℃水浴处理1h。

（4）12,000r/min离心10min，收集上清液。

（5）对上清液进行Sephadex G-50凝胶柱层析，收集ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ峰。

（6）对ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ峰进行透析，去除盐分。

（7）对透析后的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ进行SDS-PAGE电泳，鉴定纯度。

2. APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ对小鼠的致病性研究（1）将小鼠分为A、B、C三组，每组10只。

（2）A组：正常小鼠。

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种高度接触性、致死性呼吸道传染病，临床上以急性败血症、发热、咳嗽、高度呼吸困难为特征，是被国际公认的危害现代养猪业的重要疫病之一，给集约化养猪业带来了巨大的经济损失；特别是近年来本病的流行呈迅速上升且混合型感染趋势，危害日趋严重，务必引起高度重视。

一、病原与流行病学猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种呼吸道传染病。

APP 是革兰氏阴性、有荚膜的多形球杆菌，迄今已发现两个生物型共15个血清型，其中生物Ⅰ型中的1、5、9、10、11五种血清型致病力最强，生物Ⅱ型中的13和14致病性比生物Ⅰ型要弱。

我国以1、3、7血清型为主，免疫学研究证明，由于主要血清型之间缺乏交叉免疫保护作用，给本病的诊断及疫苗防治带来一定的困难。

不同品种、性别及年龄的猪对该病都有易感性，其中6周龄至5月龄的猪较多发，但以3月龄仔猪最为易感，病猪和带菌猪是本病的传染源。

APP 主要通过空气飞沫传播，在感染猪的鼻汁、扁桃体、支气管和肺脏等部位是病原菌存在的主要场所，病菌随呼吸、咳嗽、喷嚏等途径排出后形成飞沫，通过直接接触而经呼吸道传播；也可通过被病原菌污染的车辆、器具以及饲养人员的衣物等间接接触传播；小啮齿类动物和鸟类也可能传播本病。

该病的发生具有明显的季节性，多发生于4～5月和9～11月，在恶劣气候条件下极易暴发流行；此外，饲养环境突然改变、猪群的转移或混群、拥挤或长途运输、通风不良、密度过大、湿度过高、气温骤变等应激因素，均可引起本病发生或加速疾病传播，使发病率和死亡率增加。

二、流行特点近年来，随着规模化养猪业的兴起，猪传染性胸膜肺炎呈现以下新的流行特点。

1．由于饲养管理条件差，断奶仔猪发病率和死亡率明显增高。

以往虽然仔猪发病率较高，但病情一般不太严重，死亡率也较低，现在仔猪发病率和死亡率都有明显增加的趋势。

特别是不少中小型养殖户，断奶后刚转入保育舍的仔猪，由于饲养管理条件差，在气候突变、分群、变换饲料等产生的应激因素下，极易导致该病的发生，常常造成大批仔猪死亡。

猪传染性胸膜肺炎的流行病学、临床症状及防治措施-养猪技术猪传染性胸膜肺炎又称猪肺疫,是一种接触性传染病.是由于感染胸膜肺炎放线杆菌而导致,主要特征是慢性纤维素性坏死性胸膜炎和急性出血性纤维素性胸膜炎,其中急性病猪通常会发生死亡,慢性病猪往往能够耐过,但会导致生长发育缓慢,在当前生猪养殖产业化、规模化的大环境下,发病率呈现出上升的趋势,严重影响养猪业的发展,必须采取有效防治措施。

下面一起来具体了解一下：猪传染性胸膜肺炎的流行病学、临床症状及防治措施。

1、流行病学病原特性。

胸膜肺炎放线杆菌是引起该病的病原，该菌是一种革兰氏阴性杆菌，不能够自行运动，无法形成芽饱，具有多种形态，具有荚膜，且能够分泌毒素。

存在于病料中的菌体经过染色呈两极着色，经过24～96 h的人工培养能够形成丝状菌。

该菌是一种兼性厌氧菌，能够在10%二氧化碳的环境中长出黏液状的菌落。

细菌培养基中需要添加适量的维生素因子，接种在巧克力琼脂上进行24～48 h培养，能够长出直径1～2 mm的不透明菌落。

接种在牛、羊血液琼脂上，一般会发生溶血。

该菌具有较弱的抵抗力，大多数消毒药都能够将其杀灭，但能够在一定程度上抵抗壮观霉素、林肯霉素等。

传染源与传播途径。

该病的主要传染源是病猪和带菌猪，主要是猪间的直接接触以及排泄污染物等途径进行传播。

病猪主要是在鼻液、支气管以及肺脏存在病菌，通常是从鼻腔排出后，以飞沫的形式通过空气进行传播，在通风较差和拥挤环境能够使其快速传播。

发病特点。

该病的发生具有明显的季节性，通常在4～5月份和9～11月份发生。

在发生应激，如气候突变、饲养密度过大、饲养环境突然发生改变、通风较差以及长途运输等，都能够引发该病，因此也可叫做“运输病”。

另外，该病在临床上往往会混合感染副猪嗜血杆菌病、猪地方性肺炎等，促使病情加重。

2、临床症状及病理变化病猪表现出体温明显升高，能够达到大约41.5℃，精神萎靡，呼吸困难，鼻、耳、腹部皮肤发绀，呆立不动或者呈犬坐姿势，尿液呈黄色，病程后期发生便秘，临死前有大量混杂血色泡沫的液体从口、鼻中流出。