大豆根际土壤中自生固氮菌分离鉴定

大豆根际土壤中自生固氮菌的分离及鉴定【摘要】采用选择性培养基法，在大豆田采集的土壤中分离出自生固氮菌菌株，并对其进行了形态特征、分子检测。

结果表明：形态观察为自生固氮菌，采用特异性引物pcr检测，能扩增出分子量为1500 bp的特异性条带。

结合形态和分子检测，鉴定为自生固氮菌azotobacter。

【关键词】自生固氮菌；分离；鉴定；分子检测自生固氮菌广泛生存在土壤中，能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可以利用的氮素，对增加农作物产量起着重要作用。

自生固氮菌除固氮促进植物生长外，更重要的是它们能够产生多种植物激素类物质促进植物生长[1]。

研究表明自生固氮菌可以有效提高多种粮食作物的产量[2-4]。

大豆在世界上不论是总产量或是国际贸易等方面都是重要的粮食作物[5]。

近年来，国内市场供需矛盾日益突出，提高大豆产量以满足不断增长的市场需求已迫在眉睫[6]。

研究自生固氮菌的分离及鉴定，并且将传统的自生固氮菌形态鉴定方法与分子生物学相结合，旨在为进一步开展自生固氮菌的研究，提高大豆产量，改善大豆品质等奠定基础。

一、材料与方法（一）试验材料（1）供试土壤随机选取15株长势良好的大豆植株，去除表层5cm厚的杂物，采集10～20 cm厚土层土样约2 000g。

将采集的15株大豆植株根际土壤充分混匀，组成1个混合样品。

（2）培养基自生固氮菌培养基：葡萄糖（或甘露醇）10g、氯化钠0.2g、磷酸二氢钾0.2g、caso42h2o 0.1g、mgso4 0.2 g、caco3 5 g、蒸馏水1000毫升，自然ph。

（二）自生固氮菌分离（1）把采集的用于测定的土样，用1/100天平称取10g后加入盛有100ml无菌水的250ml三角瓶中，在振荡器上振荡15min，使土样均匀分散成土壤悬液。

（2）吸取1 ml土悬液至9 ml稀释液中，依次按10倍稀释，稀释为10-2，10-3，10-43个梯度，所用的移液器每次吸取土悬液时，在稀释液中反复吸入吹出3～5次，使管壁吸附部分饱和以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。

（3）混菌法进行接种。

吸取浓度10-4土悬液1ml于直径为9cm 的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却至45℃的选择性培养基约20ml，与培养皿中的土悬液充分混匀，重复5次。

待凝固后倒置于26～30℃保温培养48～72h。

（4）挑取单菌落，经镜检确认为纯培养物后，置于试管斜面在-20℃冰箱中保藏。

（三）菌落形态鉴定选取单个菌落在选择性培养基中纯化培养，适宜的温度下（25～28℃）连续培养3-4d，观察菌落边缘、表面质地和颜色等形态变化。

（四）菌株分子鉴定（1）菌丝体的准备采用lb液体培养基，在28℃，150 rmim-1振荡培养24h，10 000 rmim-1离心收集菌体。

（2）dna的提取按照细菌基因组dna提取试剂盒说明书提取dna（天根试剂公司，中国北京）1、取细菌培养液1-5ml，10，000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。

2、向菌体沉淀中加入200μl缓冲液ga，振荡至菌体彻底悬浮。

3、向管中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。

4、加入220μl缓冲液gb，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5、加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱放入收集管中），12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

7、吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8、向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

9、向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

10、将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

（3）dna样品的检测质量分数为0.9%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×tae，电压为120 v 的条件下电泳20 min，用溴化乙锭染色，在凝胶成像仪上观察电泳条带，进行拍照。

（4）pcr以菌体dna为模板，正向引物p1：（aga gtt tga tcc tgg ctc ag），反向引物p2：（aag gag gtg atc cag ccg ca） [7]pcr反应体系：pcr反应总体积50μl，25 mmoll-1 mg2+，菌体dna 2μl，2.5mmoll-1 dntps 2μl，20 μmoll-1正向引物2μl，20μmoll-1反向引物2μl，10×ex taq缓冲液5μl，taq酶（5 u/μl）0.5μl。

pcr反应条件：95℃预变性6 min；94℃ 1min，58℃ 45s，72℃90s，进行40个循环；72℃延伸5min。

（5）测序及系统发育分析将以分离得到的菌染色体dna为模板，pcr扩增，最后进行测序，将该序列送入genbank数据库利用blast软件与登录的16srdna序列进行同源性比较。

采用软件mega 4将其与genbank数据库中亲缘关系最近的已知微生物构建系统发育树。

二、结果与分析（一）菌种分离与鉴定本实验采用自生固氮菌的选择性培养基从土壤中分离出的菌，革兰氏染色见图1，初步鉴定为自生固氮菌，命名为zs-1。

（1）形态分析通过分离筛选命名为zs-1的细菌，革兰氏染色呈阴性，卵圆形或圆形。

经过三四天的培养，细胞单独存在或成对的菌体呈“8”字形排列（图1）。

图1 菌体形态（28℃ 3d）（2）16s rdna分析结果对细菌zs-1进行pcr扩增所得到的16srdna片段电泳检测结果见图2，从图中可以看到，菌株获得了片段长度约为1500bp的16srdna条带。

图2 菌株zs-1非特异性pcr扩增结果图2中：泳道1空白对照，泳道2为zs-1菌株的样品；泳道m 为dna mark 5000。

（3）序列的同源性检索及系统发育分析将测序的结果序列送入genbank数据库通过blastn程序与genbank中核酸序列进行比对分析，结果显示zs-1与azotobacter 属普遍具有较高的相似性，筛选相似性较高的典型菌株用于系统发育分析。

用于构建细菌zs-1系统发育树的菌株名称、编号及其在genebank中序列登记号为：azotobacter chroococcum（eu930421.1）、azotobacter beijerinckii（ab429527.1）、azotobacter chroococcum（ef620428.1）、azotobacter beijerinckii（ab429526.1）、azotobacter chroococcum（ab175653.1）、pseudomonas sp. gd6（gu566307.1）、pseudomonas sp. d22（gu566356.1）、pseudomonasstutzeri（gq402828.1）、azotobacter chroococcum（ef620440.1）、azotobacter chroococcum（ef620427.1）。

zs-1及相关菌株基于16s rdna区域序列构建系统进化树（图3）， zs-1与azotobacter chroococcum （eu930421.1）处于同一分支，表明两者亲缘关系最近，相似性可达99.80%。

该菌株在生长特点及菌落形态方面均与固氮菌属符合，据此初步鉴定该菌株就是自生固氮菌azotobacter。

图3 zs-1系统发育树状图（如下图）三、讨论东北地区是我国大豆主产区，特别是黑龙江省大豆播种面积较大，致使重迎茬等现象不断加重，造成大豆减产、品质下降[8-9]。

自生固氮菌能促进植物生长外，提高植物的抗逆性，保证了植物和土壤的生产能力并维持生态系统稳定[10]。

因此自生固氮菌的这种特性必将应用于大豆生产中，具有广阔的发展前景。

本研究从大豆根际土壤中分离鉴定出自生固氮菌azotobacter，为今后大豆自生固氮菌群的进一步深入研究及应用奠定了良好的基础。

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